劉國安，鄭 煒，楊慶明，馮筱璐，韓 瀟，楊 紅，丁 蘭

（西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070）

大麥提取物體外抗氧化活性檢測

劉國安＊，鄭 煒，楊慶明，馮筱璐，韓 瀟，楊 紅，丁 蘭

（西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070）

用丙酮抽提了大麥的酚類成分并檢測了總酚含量以及提取物對羥自由基、超氧陰離子的清除作用，測定了還原力和對大鼠肝微粒體脂質(zhì)過氧化的一致活性.結(jié)果表明，大麥提取物能有效清除由Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基及鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生的超氧陰離子，其活性高于Trolox；有較強(qiáng)的還原力和對脂質(zhì)過氧化的抑制作用.結(jié)果提示大麥提取物在體外有較強(qiáng)的抗氧化活性.

大麥；提取物；抗氧化活性；清除自由基

大麥?zhǔn)鞘澜绶秶鷥?nèi)的重要農(nóng)作物，中國大麥種植面積和總產(chǎn)量居水稻、小麥、玉米和粟之后第5位，主要作為飼料和釀酒原料.大麥中含有多種酚類化合物，主要包括：阿魏酸、香草酸、丁香酸、花色素苷等［1］.其中多酚類物質(zhì)的含量較高并且比較穩(wěn)定，總多酚含量可以達(dá)到1 200～1 500mg／kg［2］.有關(guān)大麥的大量研究主要集中在其遺傳多樣性和啤酒釀造制麥工藝方面.近年來國內(nèi)外學(xué)者開始關(guān)注其生理活性，研究發(fā)現(xiàn)大麥由于富含酚類化合物而具有較強(qiáng)在體外清除自由基的能力，抗氧化活性是大麥生理功能的重要組成部分［3-4］.

細(xì)胞在正常狀態(tài)下不斷地產(chǎn)生一定濃度的活性氧，體內(nèi)主要產(chǎn)生于具有免疫活性的細(xì)胞和眾多協(xié)同配合的信號傳導(dǎo)通路中.但過多的活性氧，會造成生物大分子的損傷，進(jìn)而影響機(jī)體正常的生物功能.多種癌癥、衰老及其他很多疾病的發(fā)生發(fā)展都和氧化脅迫有關(guān).因此，抗氧化劑的攝入可能預(yù)防或治療相關(guān)疾病.本文檢測了大麥的丙酮抽提成分中總酚含量，并對其多種常見氧自由基的清除作用和抑制脂質(zhì)過氧化活性進(jìn)行了檢測，以期揭示大麥提取物抗氧化作用的機(jī)理，為大麥進(jìn)一步在保健品及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

大麥（Hordeum vulgare L.）由甘肅黃河啤酒股份有限公司提供.BHT和Trolox為Sigma產(chǎn)品；其余試劑均為國產(chǎn)分析純.

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（EYELAN－1000，日本）；紫外分光光度計（HITACHI U－1800，日本）；冷凍干燥器（LGJ－18S，北京松源華興科技發(fā)展有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（Beckman L－860M）；紫外可見分光光度計（HITACHI U－1800）.

1.2 大麥中酚類成分提取

取200g干燥大麥，粉碎后加石油醚脫脂2次后，室溫下用2L80%丙酮萃取3次（每次24h），其間超聲提取1h，用Whatman No.1濾紙過濾后合并濾液，減壓回收丙酮得濃縮液，將濃縮液在40℃真空干燥，之后轉(zhuǎn)至－70℃真空冷凍干燥，所得干燥物以DMSO配制50mg／mL儲備液于4℃保存，備用.Folin－Ciocalteu比色法［5］測定總酚含量.

1.3 清除超氧陰離子能力的測定

參照陳美珍等［6］改良的鄰苯三酚自氧化法.取0.5mL不同濃度樣品，加入4.43mL 50mmol／L pH8.2磷酸緩沖液及70μL 10mmol／L鄰苯三酚溶液，在反應(yīng)啟動后每隔30s測相應(yīng)A325，至4.5min止.對照管用70μL（10mmol／L）鹽酸代替鄰苯三酚溶液，計算鄰苯三酚及每個樣品的平均自氧化速率.超氧陰離子清除率%）＝［1－（A1－A2）／A0］×100，其中，A0為未加清除劑時的自氧化速率；A1為加入清除劑時的自氧化速率；A2為未加鄰苯三酚時對照.

1.4 清除羥自由基能力的測定

根據(jù)劉立明等［7］分光光度法，稍加修改.在一系列10mL試管中分別加入1.0mL甲基紫溶液（1.03×10－5mol／L）、1.0mL FeSO4溶 液（1×10－3mol／L）、1.0mL H2O2（1.6mol／L）溶 液、1.0mL不同濃度的樣品溶液，用Tris－HCl溶液調(diào)節(jié)pH4.7，稀釋到5mL并搖勻，放置5min后，在波長582nm處測定吸光值.羥自由基清除率（%）＝ ［1－（A0－A2）／（A0－A1）］×100%，其中，A0為未加Fe2＋和H2O2時的吸光值；A1為未加清除劑時的吸光值；A2為加入清除劑時的吸光值.

1.5 還原力的測定

抗氧化物質(zhì)將三價鐵（Fe3＋）還原成二價鐵（Fe2＋）后，F(xiàn)e2＋與鐵氰化鉀生成可溶性藍(lán)色配合物KFe［Fe（CN）6］，在700nm處有最大吸收.還原力越強(qiáng)，KFe［Fe（CN）6］越多，吸光度越大，故吸光度與還原力呈正比關(guān)系.

采用Oyaiuz測定還原力的方法［8］，稍加修改.取一定濃度的受試樣品溶液1mL，加人0.2mol／L pH 6.6的磷酸鹽緩沖液和1% 鐵氰化鉀（K3Fe（CN）6）溶液各2.5mL并混合均勻，置于50℃水浴中保溫20min，然后加入2.5mL 10%的三氯乙酸，混合物在3 000×g下離心10min.吸取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸餾水和1mL 0.1%的三氯化鐵溶液，靜止10min后在700nm處測定吸光值.反應(yīng)物的吸光值越大表明還原力越強(qiáng).

1.6 抑制脂質(zhì)過氧化作用的檢測

大鼠微粒體的制備及脂質(zhì)過氧化檢測見Yang等的方法［9］.測定抑制作用時，取鼠肝微粒體于pH7.5的磷酸鉀緩沖液中，37℃振蕩孵育，其蛋白終濃度為0.3～0.5mg／mL，加入0.1mmol／L的Fe2＋／Vc啟動反應(yīng)，受試組分別加入不同濃度的樣品.1h后，15%三氯醋酸終止反應(yīng)，并加入0.67%的硫代巴比妥酸于沸水浴中反應(yīng)30min，離心后取上清于532nm處比色測定.空白組加入啟動劑后加入三氯醋酸，以不加受試化合物組為陽性對照.測定各濃度組的光吸收值.以計算樣品對丙二醛產(chǎn)生的抑制率.以上所有實(shí)驗(yàn)，每組重復(fù)3次，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.

2 結(jié)果與分析

2.1 大麥提取物中酚類成分測定

200g大麥經(jīng)丙酮提取，得到8.65g干物質(zhì)，得率為4.325%.總酚含量達(dá)3.11g／kg干重.（表1）.此結(jié)果高于以前報道［4，10］，這可能與大麥產(chǎn)地、品種等有關(guān)，另外本實(shí)驗(yàn)延長了丙酮提取時間，并通過超聲輔助提取，獲得了更多的酚類化合物.

表1 大麥提取物得率及總酚含量Tab.1 Total phenolic content and extraction yield of barley

2.2 提取物對超氧陰離子的清除能力

O－·2在細(xì)胞內(nèi)可直接導(dǎo)致DNA損傷并可使過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和肌酸激酶失活.因而對O－·2的清除至關(guān)重要.

圖1 大麥2取物和Trolox清除超氧陰離子的能力Fig.1 The hydroxyl radical scavenging capacity of barley extract and Trolox

有多種體系可以在體外誘發(fā)產(chǎn)生超氧陰離子，本實(shí)驗(yàn)采用鄰苯三酚自氧化體系產(chǎn)生O－·2，檢測大麥提取物的清除能力.如圖1所示，在低濃度（＜500μg／mL）時，和人工合成的抗氧化劑Trolox的活性相近，但隨著濃度的增高，顯示出區(qū)別.大麥在1 500.0μg／mL時清除率達(dá)到50%，而Trolox達(dá)50%清除時所需的濃度為2 468.9μg／mL，大麥提取物清除效果明顯優(yōu)于Trolox.

2.3 提取物對羥自由基的清除能力

羥自由基是氧化能力極強(qiáng)的自由基，能很容易地氧化各種有機(jī)物和無機(jī)物，氧化效率高，反應(yīng)速度快.它是造成動植物體內(nèi)細(xì)胞質(zhì)過氧化、核酸、蛋白質(zhì)和多糖分解的重要活性氧.

Fenton反應(yīng)是產(chǎn)生羥自由基的經(jīng)典體系，被認(rèn)為能模擬人體內(nèi)產(chǎn)生羥自由基的過程，以H2O2／Fe2＋體系產(chǎn)生OH·，檢測受試化合物的清除能力.結(jié)果如圖2所示，大麥提取物和Trolox活性均隨濃度升而高加強(qiáng)，呈濃度依賴性.而大麥提取物對羥自由基有很好的清除效果，在114.9μg／mL時達(dá)到50%的清除率，與Trolox的117.1μg／mL非常接近.

圖2 大麥提取物和Trolox清除羥自由基的能力Fig.2 The superoxide radical scavenging capacity of barley extract and Trolox

2.4 提取物的還原力

還原力的測定，是檢驗(yàn)樣品是否為一良好的電子提供者.還原力強(qiáng)的樣品應(yīng)為良好的電子供應(yīng)者，其供應(yīng)的電子除了可使Fe3＋還原為Fe2＋外，也可參與自由基反應(yīng)，使自由基成為穩(wěn)定的物質(zhì)，因此具有強(qiáng)的抗氧化活性.

圖3 大麥提取物和Trolox的還原力Fig.3 Reducing power of barley extract and Trolox

大麥提取物的還原力檢測結(jié)果見圖1，在測試濃度范圍內(nèi)，其活性約為Trolox的1半，相對較弱.但鑒于Trolox的特性，大麥提取物的活性也不低.

2.5 提取物抑制脂質(zhì)過氧化的作用

微粒體，尤其是其中的光滑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)含有大量的不飽和脂肪酸，極易在自由基引發(fā)劑和氧存在的條件下發(fā)生過氧化反應(yīng)，經(jīng)常作為研究氧脅迫和抗氧化作用的模型.微粒體中富含有自由基反應(yīng)所需的細(xì)胞色素C、P450、NADPH、黃素蛋白等組成，且是分離的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，這樣就排除了大體積器官水平實(shí)驗(yàn)中可能出現(xiàn)的復(fù)雜性，因而采用一定的激發(fā)劑與微粒體構(gòu)成的脂質(zhì)過氧化模型是目前研究脂質(zhì)過氧化、篩選抗氧化劑的理想方法［11］.丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過氧化的主要降解產(chǎn)物，因此，通過測定生物體MDA含量可間接指示脂質(zhì)過氧化的水平.

圖4 大麥提取物和Trolox對脂質(zhì)過氧化的抑制作用Fig.4 Inhibition of lipid peroxidation by barley extract and Trolox

本實(shí)驗(yàn)利用體外VitC／Fe2＋激發(fā)體系與微粒體構(gòu)成的脂質(zhì)過氧化模型，檢測提取物的抑制脂質(zhì)過氧化作用.從結(jié)果（圖4）可看出，相比Trolox的IC50 22.7μg／mL，大麥提取物IC50為124.9μg／mL，顯示出較弱的抑制作用.在脂質(zhì)過氧化體系中，引起脂類氧化損傷的也是OH·，這一結(jié)果與上述羥自由基的清除能力不一致，究其原因可能與Trolox較好的脂溶性而酚類的水溶性較好有關(guān).

3 討論

已有的報道表明，大麥有較強(qiáng)的還原力和金屬離子螯合能力，可清除DPPH自由基、抑制亞油酸自氧化，其中不同溶劑提取物的抗氧化活性有所差異，相對來說丙酮提取物具有優(yōu)異的抗氧化效果［4，10］.同時，大麥麩皮提取物也有較好的抗氧化性和抗突變性，可抑制亞油酸自氧化，抑制生物膜脂質(zhì)過氧化作用，有消除DPPH自由基和超氧化物的能力，可降低Ames致突變試驗(yàn)致突變性能力［12］.

由于不同的抗氧化劑作用機(jī)理不同，因此在不同的反應(yīng)體系中抗氧化能力有所差異，甚至同一種抗氧化劑在一種體系有很強(qiáng)的抗氧化活性，但在另一種體系中會無活性或是表現(xiàn)出促氧化活性，可見用單一指標(biāo)來評價物質(zhì)的抗氧化活性有很大的片面性.大部分已報道的大麥提取物活性是在DPPH或亞油酸體系中檢測的，本文采用羥自由基、超氧陰離子、還原力和脂質(zhì)過氧化體系，更接近體內(nèi)的氧化脅迫狀態(tài)，并與已知抗氧化劑Trolox對照，對其抗氧化活性進(jìn)行了較為全面的檢測及評價.結(jié)果表明，大麥提取物在體外具有較強(qiáng)的抗氧化活性，其大多數(shù)抗氧化指標(biāo)與Trolox相近，有部分活性甚至強(qiáng)于Trolox，如在清除超氧陰離子和羥自由基的體系中.物質(zhì)的還原能力可以看作為其潛在抗氧化性能的重要體現(xiàn)，還原力的強(qiáng)弱在一定程度上表示了物質(zhì)抗氧化活性的強(qiáng)弱.檢測結(jié)果顯示，大麥提取物具有一定還原力.和OH·是最常見、最主要的兩種氧自由基，在機(jī)體內(nèi)自由基鏈中最早產(chǎn)生.在需氧生物體中，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中細(xì)胞色素P450以及核膜的電子傳遞鏈都能使生物體內(nèi)普遍存在的氧分子獲得一個電子還原生成.產(chǎn)生的形式有非酶與酶促反應(yīng)兩種.其在體內(nèi)主要通過超氧化物歧化酶（SOD）催化歧化為 H2O2，逐步分解.在細(xì)胞內(nèi)可直接導(dǎo)致DNA損傷并可使過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和肌酸激酶失活.OH·是已知毒性最強(qiáng)的活性氧，對二者清除作用的研究有重要的意義.大麥提取物能有效清除超氧陰離子和羥自由基，大麥提取物在1500.0μg／mL和114.9μg／mL時，對鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生的和Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的OH·的清除率達(dá)到50%，它對兩種自由基的清除能力甚至強(qiáng)于Trolox.

脂類是各種生物膜的主要成分，因此脂類的氧化性損傷直接影響到細(xì)胞的正常功能.脂質(zhì)過氧化是自由基引起的一種最常見的生物分子損傷.微粒體脂質(zhì)過氧化是檢測脂類物質(zhì)被氧化狀態(tài)最常用的指標(biāo).MDA為脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物之一，因此測定脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA的變化能較好地反映脂質(zhì)過氧化的水平［13］.從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出，在Vit／Fe2＋誘發(fā)的微粒體脂質(zhì)過氧化體系中，大麥提取物的IC50為124.9μg／mL，表明對脂質(zhì)過氧化有較好的保護(hù)作用.

以上各反應(yīng)系統(tǒng)基于不同作用機(jī)理，反映提取物不同方面的抗氧化活性，但綜合個體系結(jié)果表明，從大麥分離出的化合物具有很強(qiáng)的抗氧化活性，可以作為篩選天然抗氧化劑、食品添加劑的有效來源，或作為保健品、醫(yī)藥用品的候選材料.

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Evaluation of in vitro antioxidant activities of Barley extracts

LIU Guoan，ZHENG Wei，YANG Qingming，F(xiàn)ENG Xiaolu，HAN Xiao，YANG Hong，DING Lan
（College of Life Science，Northwest Normal University，Lanzhou 730070）

In the present study the phenolics were extracted with 80%acetone and the total phenolics were determined.The antioxidant activities of barley extract in vitro were determine by measuring scavenging effects on the hydroxyl radical and superoxide radi－cal，reducing power，inhibition of rat liver microsome lipid peroxidation .The result showed barley extract exhibited high scavenging effects on the hydroxyl radical and superoxide radical，even more efficient than Trolox；it has effective reducing power and inhibition in lipid peroxidation.All these imply barley extract possess high antioxidation in vitro and these will be helpful to further studies of antioxidative mechanism and extensive use.

Barley；extracts；antioxidative activities；free radical scavenging

Q946

A

1000－1190（2011）04－0612－04

2011－07－02.

國家自然科學(xué)基金項目（30960464）；甘肅省教育廳研究生導(dǎo)師項目（0901－05）.

＊E－mail：liuguoan＠nwnu.edu.cn.