劉 煒，張瓊梅，史載鋒，何文英

（海南師范大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，?？?571158）

酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿與DNA相互作用的光譜研究

劉 煒＊，張瓊梅，史載鋒，何文英

（海南師范大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，海口 571158）

應(yīng)用熒光光譜法、紫外光譜法和熒光探針研究了酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿和鯡魚精DNA分子間的相互作用.在pH為7.4的Tris－HCl緩沖溶液體系中，DNA對(duì)酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿產(chǎn)生了較強(qiáng)的熒光猝滅作用，其猝滅機(jī)制判斷為靜態(tài)猝滅.計(jì)算了25℃和40℃兩個(gè)不同溫度下酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿與DNA的結(jié)合常數(shù)分別為5.38×104和5.85×102，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)分別為1.405和0.8306.根據(jù)兩個(gè)溫度下的結(jié)合常數(shù)計(jì)算出酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿與DNA反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)ΔHm＝－233.77kJ·mol－1，ΔGm（298K）＝－27.0kJ·mol－1，ΔSm（298K）＝－693.8J·K－1·mol－1，根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)確定了酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿與DNA之間的作用力以氫鍵和范德華力為主.紫外光譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著DNA濃度的增大，酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿的紫外吸收峰發(fā)生顯著降低和藍(lán)移，結(jié)合熒光探針實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿是以溝槽結(jié)合的方式與DNA結(jié)合.

酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿；DNA；相互作用；光譜

核酸是重要的生命物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)生物的生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖等有重要作用.一些藥物分子與DNA的相互作用會(huì)影響到DNA的生理和物理化學(xué)性質(zhì)，改變DNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制.DNA與靶向分子相互作用的研究不僅可以闡述一些抗腫瘤、抗病毒藥物以及致癌物的作用機(jī)理，而且對(duì)進(jìn)一步指導(dǎo)新型藥物的設(shè)計(jì)合成研究都具有重要意義［1-2］.

圖1 酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of catharanthine tartrate

酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿為夾竹桃科植物長(zhǎng)春花中提取的一種生物堿（圖1為其結(jié)構(gòu)式），目前尚未見有關(guān)其與DNA相互作用的研究報(bào)道.本文主要研究酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿與DNA相互作用的機(jī)理，獲得酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿與DNA相互作用的信息，包括反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、熱力學(xué)參數(shù)以及結(jié)合方式等，為研究酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿的藥理提供了重要信息.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

RF－5301熒光分光光度儀（Shimadzu，日本）；TU－1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；PHSJ－4A型pH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器公司）；鯡魚精DNA（sigma，美國(guó)）；酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿（海南希源化工有限公司，純度＞98%）；其它所用試劑均為分析純?cè)噭瑢?shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

在一系列10mL比色管中，依次加入1mL pH 7.4的Tris－HCl緩沖溶液，固定量的酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿溶液和不同量的DNA溶液，并用二次蒸餾水稀釋到刻度，搖勻，在熒光儀上進(jìn)行熒光光譜和吸收光譜的測(cè)定.熒光激發(fā)波長(zhǎng)選擇280nm，狹縫寬度均為5nm.

在“ABB電力與自動(dòng)化世界”上，ABB集中發(fā)布了68款新品，并向中國(guó)市場(chǎng)推出20項(xiàng)ABB AbilityTM數(shù)字化產(chǎn)品和解決方案以及最新的數(shù)字化平臺(tái)，支持電力、工業(yè)、交通與基礎(chǔ)設(shè)施等領(lǐng)域的用戶加快數(shù)字化轉(zhuǎn)型。這也是一年多來(lái)ABB最大規(guī)模向中國(guó)用戶集中展示ABB在數(shù)字化領(lǐng)域取得的最新技術(shù)成就和重要突破。

根據(jù)靜態(tài)猝滅公式

2 結(jié)果與討論

2.1 DNA對(duì)酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿熒光光譜的影響

圖2為pH 7.4tris－HCl緩沖液中DNA存在下酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿的熒光發(fā)射光譜.從圖2中可以看出，酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿在357nm處有一最大發(fā)射峰，DNA存在可使酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿357nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度發(fā)生猝滅，隨著DNA濃度增大猝滅程度逐漸增強(qiáng)，表明DNA和酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿可能形成了復(fù)合物.熒光猝滅可分為靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅2大類，根據(jù)猝滅Stern－Volumer方程

圖2 DNA存在下酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿的熒光發(fā)射光譜Fig.2 The fluorescence emission spectra of catharanthine tartrate in the presence of DNA

圖3為pH 7.4tris－HCl緩沖液中DNA存在下酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿的紫外吸收光譜.從圖3中可以看出，酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿在280nm處有一紫外吸收峰，隨著DNA濃度的增大，酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿的紫外吸收峰發(fā)生顯著降低和藍(lán)移，由于有機(jī)分子與DNA以嵌入或溝槽方式結(jié)合時(shí)會(huì)導(dǎo)致有機(jī)分子的紫外吸收峰強(qiáng)度發(fā)生升高或降低，同時(shí)最大吸收峰波長(zhǎng)會(huì)發(fā)生藍(lán)移或紅移［7-9］，因此酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿與DNA可能是以嵌入或溝槽的方式結(jié)合.

2.2 DNA對(duì)酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿紫外吸收光譜的影響

F0與F分別代表總的和游離態(tài)的藥物的熒光強(qiáng)度，τ0為猝滅劑不存在時(shí)物質(zhì)的熒光壽命，［Q］為猝滅劑的平衡濃度.可計(jì)算出猝滅常數(shù)KSV＝1601L·mol－1，由于生物大分子的熒光平均壽命大約為10－8s［4］，因此可算出相應(yīng)的雙分子猝滅過(guò)程速率常數(shù)Kq＝1.60×1011L·mol－1·S－1，遠(yuǎn)大于各類猝滅劑對(duì)生物大分子最大擴(kuò)散碰撞猝滅速率常數(shù)（Kq＝2.0×1010L·mol－1·s－1）［5-6］，證明酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿對(duì)BR－DNA體系的猝滅屬于靜態(tài)猝滅.

圖3 DNA存在下酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿的紫外吸收光譜Fig.3 The UV absorption spectra of catharanthine tartrate in the presence of DNA

2.3 DNA與酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿二元絡(luò)合物的組成及其結(jié)合常數(shù)

在一系列10mL比色管中，依次加入1mLpH 7.4的Tris－HCl緩沖溶液，固定量的鹽酸小檗堿溶液、DNA溶液和不同量的酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿溶液，再用二次蒸餾水稀釋到刻度，搖勻，在熒光儀上進(jìn)行熒光光譜測(cè)定.熒光激發(fā)波長(zhǎng)選擇358nm，狹縫寬度均為5nm.

根據(jù)藥物小分子與生物大分子作用的有關(guān)熱力學(xué)參數(shù)可以簡(jiǎn)單判斷其相互作用類型［11］：若ΔH ＞0及ΔS＞0則主要表現(xiàn)為疏水作用，ΔH＜0及ΔS＞0主要表現(xiàn)為靜電作用，ΔH＜0及ΔS＜0主要表現(xiàn)氫鍵或者范德華作用.

圖4 25℃（a）和40℃（b）時(shí)DNA和酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)Fig.4 The binding constant and binding sites number of the interaction between catharanthine tartrate and DNA at 25℃（a）and 40℃（b）.

2.4 酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿與DNA結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)性質(zhì)及作用力

根據(jù)酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿與DNA的結(jié)合常數(shù)K1（298K）＝5.38 ×104，K2（313K）＝5.85 ×102，按式（3）～（5）可以求得二者結(jié)合過(guò)程的熱力學(xué)函數(shù)：ΔHm＝－233.77kJ·mol－1，ΔGm（298K）＝－27.0kJ·mol－1，ΔSm（298K）＝－693.8J·K－1·mol－1，由此可初步判斷酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿與DNA間是以氫鍵或者范德華作用力結(jié)合為主.

F0與F分別代表總的和游離態(tài)的藥物的熒光強(qiáng)度，K為酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿與猝滅劑之間的結(jié)合常數(shù)，c為猝滅劑的平衡濃度，n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，由式（2）分別作出不同溫度下酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿－DNA體系的關(guān)系圖，結(jié)果如圖4，通過(guò)斜率和外推截距可以求出酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿與猝滅劑之間的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù).由圖4可知，25℃時(shí)酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿與DNA之間的結(jié)合常數(shù)為5.38×104，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為1.405，線性相關(guān)系數(shù)為0.9930；40℃時(shí)酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿與DNA之間的結(jié)合常數(shù)為5.85×102，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為0.8306，線性相關(guān)系數(shù)為0.9947.

暫不考慮總重，為了平衡跨中的活載，同前，當(dāng)預(yù)應(yīng)力度分別取為1和0.5時(shí)得到的剪力滯系數(shù)沿著跨徑方向的變化曲線如圖10所示。

藥物小分子與生物大分子的作用力包括氫鍵、范德華力、靜電引力、疏水作用力等，藥物不同，與DNA作用力類型也不同.當(dāng)溫度變化不大時(shí)，反應(yīng)的焓變可視作常數(shù)，根據(jù)熱力學(xué)公式可以計(jì)算藥物小分子與生物大分子作用間的有關(guān)熱力學(xué)參數(shù)：

教書育人中教師角色該如何定位？這是每一個(gè)教師應(yīng)該經(jīng)常思考的問(wèn)題。我想到了年少時(shí)在農(nóng)村放牛的情景。放牛時(shí)，牧者與牛之間的位置關(guān)系和牛的神態(tài)動(dòng)作有著密切的關(guān)系。當(dāng)人走在牛的前面時(shí)，牛的頭總是低著的，而且表現(xiàn)出漫不經(jīng)心、極不情愿的樣子；當(dāng)人走在牛的后面時(shí)，牛的頭總是仰著的，表情神態(tài)自若，積極前行；人和牛處于平行位置同步前行時(shí)，牛的神態(tài)則是多樣的，或低或仰，表情不一。

2.5 酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿對(duì)小檗堿－DNA體系熒光強(qiáng)度影響的研究

鹽酸小檗堿（BR）是以治療腸道痢疾而著稱的黃連素，可以專一性地插入DNA雙螺旋的堿基對(duì)之間，使本身很弱的熒光得到顯著性增強(qiáng)，當(dāng)鹽酸小檗堿從雙螺旋中出來(lái)時(shí)，熒光又顯著性降低，因此可作為熒光探針研究DNA與小分子化合物的相互作用［12-13］.若酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿和 DNA 是以嵌入的方式結(jié)合，則酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿可與BR競(jìng)爭(zhēng)DNA的結(jié)合位點(diǎn)，將BR從DNA分子中擠出，從而使BR－DNA體系的熒光強(qiáng)度（λex＝358nm，λem＝530nm）降低.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿濃度的增大，BR－DNA體系熒光強(qiáng)度基本不變，說(shuō)明了酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿與DNA之間不是嵌入結(jié)合.

中小企業(yè)是經(jīng)濟(jì)良好運(yùn)行的關(guān)鍵一環(huán)，也是為宏觀經(jīng)濟(jì)注入活力的重要組成部分，然而中小企業(yè)融資困境卻長(zhǎng)期制約他們的發(fā)展，融資機(jī)會(huì)過(guò)于集中大型企業(yè)，而使得中小企業(yè)發(fā)展緩慢。信息不對(duì)稱以及中小企業(yè)自身的道德風(fēng)險(xiǎn)是中小企業(yè)融資困境的根本原因。隨著互聯(lián)網(wǎng)金融的飛速發(fā)展、大數(shù)據(jù)技術(shù)的成型，融資困境不僅迎來(lái)了新的轉(zhuǎn)機(jī)，也出現(xiàn)了新的窗口新的機(jī)會(huì)。

2.6 作用機(jī)理探討

小分子探針與雙螺旋DNA結(jié)合方式主要包括靜電式、嵌入式和溝槽式3種模式.根據(jù)熒光探針實(shí)驗(yàn)，酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿對(duì)BR－DNA體系熒光強(qiáng)度不產(chǎn)生猝滅作用，證明酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿與DNA不是嵌入式結(jié)合；結(jié)合酒石酸長(zhǎng)春質(zhì)堿和DNA反應(yīng)的紫外吸收譜圖，說(shuō)明長(zhǎng)春堿與DNA應(yīng)該是以溝槽結(jié)合的方式相互作用.

［1］吳會(huì)靈，楊芃原，張重杰，等.小分子與核酸相互作用的研究進(jìn)展［J］.分析化學(xué)，2004，32（9）：1256－1261.

［2］李 靜，李景印，郭玉鳳.生物小分子與DNA相互作用的光譜及電化學(xué)研究進(jìn)展［J］.化學(xué)研究，2005，16（4）：101－104.

［3］Eftink M R，Ghiron C A.Fluorescence quenching studies with proteins［J］.Anal Biochem，1981，114：199－227.

［4］肖厚榮，盛良全，施春華.水楊酸與牛血清蛋白相互作用的熒光光譜研究［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2004，24（1）：78－81.

［5］Kandagal P B，Seetharamappa J，Shaikh S M T，et al.Binding of trazodone hydrochloride with human serum albumin：A spectroscopic study［J］.J Photochem Photobiol A，2007，185：239－244.

［6］鄧勝國(guó)，鄧澤元，范亞葦，等.荷葉中紫云英苷和DNA相互作用的光譜學(xué)研究［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2010，30（2）：476－480.

［7］Kumar C V，Asuncion H E.DNA binding studies and site selective fluoscence sensitization of an anthryl probe［J］.J Am Chem Soc，1993，115：8547－8553.

［8］劉 煒，楊麗珠，蔣麗萍，等.Ca－ALC絡(luò)合物和魚精子DNA反應(yīng)的電化學(xué)與光譜研究［J］.華中師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2005，39（1）：79－83.

［9］劉 煒，張瓊梅，畢和平.硫酸長(zhǎng)春堿與DNA相互作用的機(jī)理研究［J］.海南師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，23（4）：403－406.

［10］Kandagal P B，Ashoka S，Seetharamappa J，et al.Study of the interaction of an anticancer drug with human and bovine serum albumin：spectroscopic approach［J］.J Pharm Biomed Anal，2006，41（2）：393－399.

［11］Ross D P，Sabramania N S.Thermodynamics of protein association reactions：forces contributing to stability［J］.Biochemistry，1981，20：3096－3102.

［12］賀吉香，江崇球，高明霞，等.鹽酸小檗堿與脫氧核糖核酸相互作用的研究［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2003，23（4）：755－758.

［13］沈景山，孫丹丹，付連春，等.熒光光譜法研究抗癌藥物與DNA的相互作用［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2005，25（2）：232－234.

Study on the interaction between catharanthine tartrate and DNA by spectrometric method

LIU Wei，ZHANG Qiongmei，SHI Zaifeng，HE Wenying
（College of Chemistry and Chemical Engineering，Hainan Normal University，Haikou 571158）

The interaction of catharanthine tartrate and DNA was studied using UV spectrometry，fluorescence spectrometry and fluorescent probe.The results showed that the fluorescence intensity of catharanthine tartrate was quenched in the presence of DNA，and this mechanism was judged as static quenching.The binding constant Kat 25℃and 40℃ were calculated as 5.38×104and 5.85×102，and the binding sites number nas 1.405and 0.8306.According to the binding constant Kat 25℃and 40℃，the thermodynamic parameters of the reaction of catharanthine tartrate and DNA were calculated as follows：ΔHm＝－233.77kJ·mol－1，ΔGm（298K）＝－27.0kJ·mol－1，ΔSm（298K）＝－693.8J·K－1·mol－1，and the main binding force between catharanthine tartrate and DNA is hydrogen bonding or van der Waals force according to thermodynamic parameters.The UV spectrometry test showed that as the DNA concentration increased，the blue shift of the absorbance peak occured and the absorbance decreased significantly，the results of fluorescence probe test further proved that catharanthine tartrate binds with DNA in a mode of groove binding.

catharanthine tartrate；DNA；interaction；spectrometry

O657.32

A

1000－1190（2011）04－0595－04

2011－07－16.

海南省教育廳項(xiàng)目（Hjkj2009－39）；海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（209004）.

＊E－mail：liuwei1224＠126.com.