包怡紅，李銳達

（東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，哈爾濱 150040）

乳清多肽的分離純化及體外抗氧化活性研究

包怡紅，李銳達

（東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，哈爾濱 150040）

采用乳酸菌發(fā)酵乳清制備乳清多肽，利用超濾和凝膠Sephadex G-25分離純化乳清多肽，并研究了超濾后乳清多肽對羥自由基、氧自由基和DPPH自由基的清除作用。結(jié)果表明，超濾后乳清多肽主要包含兩個級分，分子量分別為2 031 u和328 u，對羥自由基、氧自由基和DPPH自由基具有清除作用。

乳清多肽；分離純化；抗氧化

0 引 言

隨著生活水平的提高，人們對食品安全的關(guān)注度日益升高，天然抗氧化劑越來越受到人們的青睞，近年來，關(guān)于蛋白水解物抗氧化性的研究已有許多報道，如大豆蛋白[1]、玉米蛋白[2]、豬血蛋白等[3]。

乳清是生產(chǎn)干酪或干酪素時的副產(chǎn)品，含有15%以上的蛋白質(zhì)[4]，是一種來源廣泛的蛋白資源。隨著具有各種生物活性短肽的不斷發(fā)現(xiàn)，對乳清多肽的研究和開發(fā)日益受到人們的關(guān)注，目前已有關(guān)于乳清蛋白水解物抗氧化作用的研究報道[5-7]。本課題前期工作中采用乳酸菌水解乳清蛋白制備乳清多肽[8]，本實驗采用超濾、凝膠層析對發(fā)酵液進行分離純化，并研究其體外抗氧化活性，進一步了解乳清多肽結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，從而為乳清生物活性肽作為新型抗氧化劑的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫鹽乳清粉；保加利亞桿菌L34.5；嗜熱鏈球菌SP1.1；還原型谷胱甘肽；氧化型谷胱甘肽；VB12；Sephadex G-25；Tris；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)控自動部分收集器；HL-2B蠕動泵；TP10-20超濾設(shè)備；T6新世紀紫外分光光度計；722S可見分光光度計。

1.3 方法

1.3.1 乳清蛋白多肽的制備[8]

乳清粉按10%（質(zhì)量分數(shù)）復(fù)原后，采用保加利亞桿菌和嗜熱鏈球菌（菌種比1∶1）復(fù)合發(fā)酵，發(fā)酵條件：初始pH值為6.4，發(fā)酵溫度37℃，接種量5%，發(fā)酵時間14 h。發(fā)酵完畢后，沸水浴3 min滅酶，冷卻，4 000 r/min離心10 min取上清液，待用。

1.3.2 超濾分離純化

在一定的操作壓力、操作溫度下，選用截留相對分子質(zhì)量為6 ku的聚砜類中空纖維膜進行超濾，收集濾過液，經(jīng)真空濃縮、冷凍干燥得超濾預(yù)分離的乳清多肽，用作進一步實驗使用。

1.3.3 SephadexG-25柱層析分離純化[9]

（1）凝膠色譜測定條件。紫外檢測波長λ=285 nm；洗脫液：蒸餾水；流速：0.6 mL/min；溫度為室溫23℃；樣品質(zhì)量濃度為40 g/L；加樣量為1 mL。

（2）分析方法。取鉻酸鉀、還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、VB12各10 mg，分別溶于1 mL洗脫液中，制成標準溶液。

將已處理好的交聯(lián)葡聚糖凝膠Sephadex G-25（1 cm×45 cm）裝柱，在前述凝膠色譜測定條件下操作，用記錄儀記錄流出液吸收情況。洗脫液洗脫至基線平穩(wěn)，加入標準溶液或3%的樣品溶液1 mL，用量筒記錄最大吸收峰出現(xiàn)時洗脫液的流出體積（mL），以流出體積為縱坐標，標準分子量的對數(shù)（lgM）為橫坐標繪制標準曲線。

1.3.4 羥自由基清除率的測定[10]

在試管中分別加入0.5 mL濃度為10 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液、0.5 mL樣液、0.5 mL濃度為10 mmol/L的FeSO4溶液、3.5 mL蒸餾水，最后加入5 mL濃度為100 mmol/L的H2O2啟動Fenton反應(yīng)，搖勻后于510 nm處測定吸光度Ai；取0.5 mL蒸餾水代替濃度為10 mmol/L的FeSO4溶液，測得的吸光度為Aj；取0.5 mL蒸餾水代替酶解液，測得的吸光度為A0。

1.3.5 氧自由基清除率的測定[11]

采用鄰苯三酚自氧化法測定。在試管中依次加入4.5 mL濃度為0.1 mol/L的Tris-HCl（pH值為8.2，內(nèi)含濃度為2 mmol/L的EDTA）緩沖溶液，4.2 mL雙蒸水，于25℃恒溫20 min后加入25℃預(yù)熱過的0.3 mL濃度為3 mmoL/L鄰苯三酚溶液（以濃度為10 mmol/L的HCl配制，對照管用濃度為10 mmol/L鹽酸代替），迅速搖勻，立即傾入比色皿中，在波長325 nm處每30 s測定一次吸光值A(chǔ)，計算線性范圍內(nèi)每分鐘A的增值，此即為鄰苯三酚的自氧化速率A0。乳清抗氧化肽活性測定按上述操作，加入鄰苯三酚前，先加入一定量樣液，并減少同體積雙蒸水，其他操作均與上述相同，所測吸光度為Ai。

2 結(jié)果與討論

2.1 超濾對乳清水解產(chǎn)物抗氧化活性的影響

乳清蛋白水解產(chǎn)物在操作壓力0.04 MPa（操作溫度25℃）下通過超濾膜。超濾前后乳清蛋白多肽的氧自由基清除率比較如圖1所示。

為了將乳清多肽混合物進行有效分離，本研究選用了超濾作為初步的分離手段。有研究[12]發(fā)現(xiàn)低分子量的乳清蛋白酶解物（小于6 ku）具有較好的抗氧化活性，因此實驗采用截留相對分子量為6 ku的纖維膜對發(fā)酵液進行超濾處理。由圖1可以看出，透過液的氧自由基清除率與超濾前相比有了明顯提高，同時與濃縮液相比接近于兩倍，透過液的氧自由基清除率得到提高也可能與抗氧化肽通過超濾得到了濃縮有關(guān)。

2.2 SephadexG-25凝膠層析分析

2.2.1 肽分子量標準曲線的確定

2.2.2 乳清多肽的凝膠層析分析

Sephadex G-25的上限截留分子量為5 000 D，超濾后的乳清水解液經(jīng)Sephadex G-25凝膠過濾色譜分離結(jié)果如圖3所示。

隨著洗脫的進行分離得到的洗脫液紫外吸收度呈上升趨勢，當達到一個最大值后又均呈下降趨勢，當洗脫液體積達到60 mL左右時，多肽可被最大程度地洗出。組分Ⅱ峰高明顯大于組分Ⅰ，說明組分Ⅱ在超濾混合物中所占比例較大。根據(jù)肽標準曲線直線方程y=-30.29x+118.19計算得組分Ⅰ和組分Ⅱ的相對分子量分別為2031 u和328 u，進一步說明水解物主要是一些小肽的混合物。

將分離后的組分Ⅰ和組分Ⅱ進行抗氧化活性比較，從圖4可以看出，分離組分Ⅱ的氧自由基清除率大于組分Ⅰ，與透過液相比兩者的氧自由基清除率都有顯著提高，這可能與凝膠層析過程中產(chǎn)品中一些小分子糖類、游離氨基酸、無機鹽等成分被逐漸分離，肽得到進一步濃縮有關(guān)。

2.3 超濾產(chǎn)物乳清多肽的抗氧化活性

2.3.1 清除羥自由基作用

由圖5可知，乳清多肽對羥自由基具有清除作用，其對羥自由基的清除率隨著濃度的增加而明顯增強，說明乳清多肽具有抗氧化作用，但清除效果低于同濃度條件下的VC，其半數(shù)抑制質(zhì)量濃度IC50為6.31 g/L。

2.3.2 清除氧自由基作用

由圖6可以看出，乳清多肽的氧自由基清除能力呈現(xiàn)量效關(guān)系，隨著濃度的增加逐步增強，但均小于同濃度條件下的VC溶液，其半數(shù)抑制質(zhì)量濃度IC50為6.59 g/L。結(jié)果表明乳清多肽具有抗氧化性，能夠抑制氧自由基引起的氧化損傷。

2.3.3 清除DPPH自由基作用

實驗比較了不同濃度的乳清多肽和VC對DPPH自由基的清除能力，由圖7可以看出乳清多肽具有一定的DPPH自由基清除能力，且隨其濃度的增大而增大，但清除效果明顯低于VC，其半數(shù)抑制質(zhì)量濃度IC50為6.07 g/L。

3 結(jié) 論

采用超濾法與凝膠過濾色譜相結(jié)合的實驗方法對乳清蛋白發(fā)酵產(chǎn)物進行了分離并獲得兩個級分，超濾后的乳清多肽具有一定的自由基清除能力，顯示了抗氧化活性。乳清多肽的抗氧化活性不如它的陽性對照物，但由于乳清多肽是一種天然抗氧化劑，成本低廉，因此對它的研究開發(fā)具有很好的經(jīng)濟價值和應(yīng)用潛力。

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Study on purification and antioxidation of whey protein peptides

BAO Yi-hong,LI Rui-da
（College of Forestry,Northeast Forestry University,Harbin 150040，China）

Whey protein peptides were prepared by the Latic Acid Baceria Fermentation and then purified with ultrafiltration and Sephadex G-25 column,the scavenging rate of OH·,O2·-and DPPH·of whey protein peptides purified with ultrafiltration were also studyed.The results showed that whey protein peptides purified with ultrafiltration contain two fractions mainly,their relative molecular weight were 2031 D、328 D respectively,it displayed a scavenging activity to the OH·,O2·-and DPPH·.

whey protein peptides;purification;antioxidation

Q516

A

1001-2230（2011）10-0012-03

2011-08-20

黑龍江省博士后科研啟動資金項目（LBH-Q08142）。

包怡紅（1970-），女，教授，研究方向為功能食品與食品發(fā)酵。