顏景超，任國譜，安靜，張曉雷

（中南林業(yè)科技大學(xué)a.食品科學(xué)與工程學(xué)院；b.生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，長沙 410004）

高效液相色譜法測定乳制品中維生素A的研究進展

顏景超a，任國譜a，安靜b，張曉雷a

（中南林業(yè)科技大學(xué)a.食品科學(xué)與工程學(xué)院；b.生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，長沙 410004）

從樣品處理、色譜分離和檢測方面對近年來高效液相色譜色譜法測定牛奶及乳制品中維生素A的研究進行了綜述。另外，對研究中存在的問題進行了簡單的討論。

維生素A；牛奶；奶粉；嬰兒配方奶粉；高效液相色譜法

0 引 言

維生素A是一種重要的脂溶性維生素，其主要生理功能是維持視覺和骨骼健康、參與細胞分裂和細胞識別、參與生殖及維持免疫系統(tǒng)的完整性等[1]。維生素A也作為一種重要的食品營養(yǎng)添加劑，被添加到各類食品中特別是乳制品中以應(yīng)對全球性的兒童維生素A缺乏這一嚴(yán)重的營養(yǎng)缺乏問題。為了控制產(chǎn)品質(zhì)量，避免不合理添加帶來潛在危害，需要對產(chǎn)品中維生素A的質(zhì)量進行測定。本文對近年來國內(nèi)外液相色譜測定乳制品中維生素A的研究進展進行了綜述，為相關(guān)人員未來的研究提供一定的參考。

表1 高效液相色譜法測定奶粉等中維生素A的研究情況

1 維生素A高效液相色譜測定

近年來，高效液相色譜已經(jīng)被廣泛用于檢測牛奶、奶粉和嬰兒配方奶粉（IF）中的維生素A，部分研究結(jié)果如表1所示。

1.1 樣品制備

1.1.1 溶解均化

為了更好了萃取樣品中的維生素A、非液態(tài)樣如奶粉、嬰兒配方奶粉等，需先對進行樣品溶解，混合均勻。

1.1.2 蛋白質(zhì)沉淀

樣品中的蛋白質(zhì)會對測定產(chǎn)生不利的影響，殘留的蛋白質(zhì)會使系統(tǒng)壓力迅速增大并且影響柱的分離，因此需要對其進行處理。由于蛋白質(zhì)在極性溶液中溶解性較差，因此在試驗中一般使用極性有機溶液來降低其溶解性以幫助去除蛋白質(zhì)，常用的溶劑有乙腈、丙酮、甲醇、乙醇等，用量根據(jù)樣品的量而定，但要避免使用酸來沉淀蛋白質(zhì)，因為酸會造成視黃醇的葡糖苷酸的水解，而且也可導(dǎo)致視黃醇的脫水。

1.1.3 維生素A的分離

生乳中的維生素A主要是以酯化的形式存在，分布在乳脂肪中[22]，且添加的維生素A類營養(yǎng)強化劑一般也是選擇其醋酸酯和棕櫚酸酯的形式，相對于維生素A的酯化形式，游離的視黃醇的量可以忽略不計[22]。

（1）皂化處理。

為了準(zhǔn)確測定全部維生素A的量，前處理過程中一般需要對樣品進行皂化處理，一方面使內(nèi)源性的維生素A與脂肪脫離，另一方面將維生素A的酯轉(zhuǎn)變成視黃醇。皂化的可以采用不同的條件，如室溫下過夜皂化[3，4]、40℃皂化30 min[7，8]、52℃左右皂化45 min、80℃皂化25 min[18]、80℃皂化30 min[5，6]等，皂化時可以攪拌以提高效果。一般皂化溫度高，皂化時間就短，但是要避免溫度過高對樣品中維生素A造成破壞，另外皂化過程中一般要沖入氮氣，防止維生素A被氧化。

（2）酶解處理。

Turner等[14，15]研究使用脂肪酶等酶來處理樣品，加入適當(dāng)?shù)拿缚商娲砘詫崿F(xiàn)維生素A與脂肪的分離和將酯化形式轉(zhuǎn)化為視黃醇。

1.1.4 維生素A的萃取

（1）液液萃取。

液液萃取雖然有缺點，如使用的溶劑往往有一定的毒性，操作比較繁瑣耗時，但仍是目前應(yīng)用最廣泛的方法。

樣品經(jīng)過皂化或者酶解處理以后，需要用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒕S生素A萃取出來。萃取溶劑為非極性有機溶劑，常用的有石油醚[2-3,6,17]、正己烷[4]、乙醚[5]。 為了提高萃取效率，可多次萃取，最后合并有機層。皂化后使用適當(dāng)?shù)娜軇┻M行萃取是目前最為經(jīng)典的方法。

如果要檢測樣品中的維生素A酯的量，則前處理時不可采用皂化處理。在對蛋白質(zhì)進行沉淀后，加入一定量的非極性的有機溶劑，多使用正己烷[12，13,16,19]、醚類[10]或兩者都用[20]，劇烈震蕩一定時間后離心，收集有機層。為了最大限度的萃取維生素A，以上步驟可以重復(fù)幾次，最后合并有機層。為了使溶液更好的分層及加速相分配，處理時可加入飽和鹽溶液[9,19]。

顏景超等[9]在研究中使用甲醇和三氯甲烷的混合溶劑處理嬰兒配方奶粉。N.Rodrigo等[23]在測定嬰兒配方奶粉的生育酚時，也使用了混合溶劑處理樣品。以往的研究就已經(jīng)表明[24]，混合溶劑在計量和成分構(gòu)成合理的情況下，可以沉淀蛋白，釋放視黃醇類物質(zhì)，并且有效地提取視黃醇。

另外，無論是否采取皂化處理，在進樣之前，一般都要將含有維生素A的有機溶劑在惰性氣體（一般為氮氣）的保護下吹干，然后選擇適當(dāng)?shù)娜軇┰偃芙夂筮M樣，溶劑的選擇要考慮流動相和色譜柱的極性。

（2）加壓溶劑萃取。

Delgado-Zamarre～no[16]等在嬰兒配方奶粉的前處理中引入快速溶劑萃取系統(tǒng)配合加壓溶劑萃取，不需對樣品進行皂化，同樣取得了很好的測定效果。

（3）固相萃取。

另外一種在蛋白質(zhì)沉淀以后對樣品濃縮和純化的方法是固相萃取。固相萃取基于選擇性吸附與選擇性洗脫的液相色譜法分離原理，目前已廣泛的應(yīng)用于樣品制備，相比于傳統(tǒng)的液液萃取，其高效便捷[25]。雖然這種方法近年來越來越受歡迎，但是在乳制品中的維生素A分析中應(yīng)用的并不多。Blanco等[13]和Heudi等[18]曾將固相萃取應(yīng)用于測定牛奶或嬰兒配方奶粉中維生素A的前處理中。

（4）超臨界流體萃取。

超臨界流體具有類似于液體的較大密度、溶解度和類似氣體的較強穿透力，具有良好的溶劑特性，可作為溶劑用于單體的萃取和分離[26]，且超臨界流體萃取可節(jié)省有機溶劑用量，更加環(huán)保。Turner等[7，8,14，15]在研究中使用SFE萃取奶粉等中的維生素A，并且還將SFE于酶解等結(jié)合[14，15]，取得了很好的純化分離效果。Turner等在研究中使用體積分?jǐn)?shù)為1%～3%的乙醇[14，15]或者4%～5%甲醇[7，8]作為夾帶劑。

除了經(jīng)典的皂化處理與液液萃取外，研究人員將酶解、加壓溶劑萃取、固相萃取和超臨界流體萃取等應(yīng)用到樣品的前處理中，這些都極大的豐富了維生素A的前處理方法，為以后的研究提供了很好的參考。

1.2 色譜分離

高效液相色譜已經(jīng)成為分離和定量分析乳制品中維生素A的最主要的工具。高效液相色譜通常分為正相色譜和反相色譜。

1.2.1 正相色譜

正相色譜的固定性一般為極性物質(zhì)如硅膠或者通過極性基團如氰基/氨基或者短的烷基等改性的硅膠。洗脫液使用非極性溶劑如正己烷，洗脫液中也可以加入少量的極性調(diào)節(jié)溶液如異丙醇或氯仿。正相色譜對于流動相的變化很敏感，所以使用梯度洗脫的話就需要很長的時間進行平衡，比較耗時。相對于反相色譜，正相色譜在乳制品中維生素A的測定中應(yīng)用的較少[17-21]，詳見表1。當(dāng)不采用皂化處理時，因考慮到樣品中脂肪含量的影響而傾向使用正相色譜[19-21]。

1.2.2 反相色譜

反相色譜是通過待分離物質(zhì)在流動相和極性洗脫液之間的相分配完成的。反相色譜的固定相一般為C18或者C8，洗脫液使用極性溶劑如水、甲醇、乙腈等，或者幾種溶劑的混合溶劑。反相色譜因其穩(wěn)定性高于正相色譜而被廣泛的應(yīng)用。目前，大多數(shù)研究都使用反相色譜測定乳制品中的維生素A[2-16]，詳見表1。

隨著技術(shù)的進步，色譜柱的口徑和填充物顆粒都越來越細，分離效果也越來越好。另外，無論使用哪種色譜柱，絕大多數(shù)研究都是使用梯度洗脫[2-21]，而流速因研究差異有所不同。

1.3 檢測

維生素A經(jīng)過色譜柱分離以后，需要對其進行定量測定。鑒于其物質(zhì)結(jié)構(gòu)性質(zhì)，目前較為常用的檢測器有紫外檢測儀，二極管陣列[2-15,17,19]，熒光檢測儀[7,20，21]，另外，也有報道使用電化學(xué)法[16]和質(zhì)譜檢測[18]。

1.3.1 紫外檢測

維生素A含有多個共軛結(jié)構(gòu)的碳碳雙鍵，因此可吸收300～400 nm范圍內(nèi)的紫外光，最大吸收波長在325 nm左右[27]。目前，紫外檢測器應(yīng)用最多，但現(xiàn)在越來越多的研究使用二極管陣列（DAD），以更加準(zhǔn)確的定性和同時實現(xiàn)多種物質(zhì)的檢測。

1.3.2 熒光檢測

當(dāng)有近紫外光激發(fā)時，維生素A可發(fā)出淡綠色的熒光，激發(fā)波長在325～335 nm之間，發(fā)射波長的最大值在470～490 nm之間，溶劑不同略有差異[27]。因此可以使用熒光法檢測維生素A，具體研究選用的波長有所不同，詳見表1。

1.3.3 其他檢測

由于各種限制，諸如電化學(xué)檢測和質(zhì)譜等在實際中應(yīng)用的很少。

另外，因受各種實驗條件的影響，各種檢測手段的檢出限有所不同，一般紫外檢測就可以很好的滿足日常測定的精度要求。

1.3.4 定性和定量

內(nèi)標(biāo)法可以提高方法的準(zhǔn)確度和精度，但是維生素A可用的內(nèi)標(biāo)物較少，因此實際應(yīng)用較少。而目前維生素A的標(biāo)準(zhǔn)樣純度很高且色譜儀器的精密度也很高，外標(biāo)法已可以很好的滿足分析要求，從而被廣泛應(yīng)用于維生素A的測定中。

2 問題與展望

隨著分析儀器和方法的不斷改進提高，乳制品中維生素A的測定已經(jīng)日臻成熟。但是，目前仍然存在一些問題沒有很好的解決，其中最主要的就是維生素A各種異構(gòu)體的檢測，雖然有研究嘗試解決各種異構(gòu)體的檢測[28-30]，但是還不成熟。原因主要有兩個方面：一是缺乏各種異構(gòu)體的標(biāo)準(zhǔn)樣；二是樣品中各種異構(gòu)體含量很低而且相互轉(zhuǎn)化很快，因此很難準(zhǔn)確測定含量。而維生素A的各種異構(gòu)體是具有維生素A活性的，現(xiàn)實中對于樣品中總的維生素A生物活性往往是低估的，這就可能造成潛在的風(fēng)險。但是，相信隨著技術(shù)的不斷進步，在不久的將來人們一定會有效的解決這些存在的問題，為進一步提高乳制品的質(zhì)量水平提供有力的支撐。

[1]OLSON J A.Recommended Dietary Intakes（Rdi）of Vitamin A in Humans[J].Am.J.Clinical Nutrition,1987,45：704-716.

[2]GB 5413.9-2010嬰幼兒食品和乳品中維生素A、D、E的測定[S].

[3]劉波,郎昭濱,殷曉紅，等.高效液相色譜法測定乳粉中維生素A、D[J].中國乳品工業(yè),2003,31（2）：36-38.

[4]ALBALA＇-HURTADO S,NOVELLA-RODRI＇GUEZ S,VECIANA-NOGUE?S M T,et al.Determination of Vitamins A and E in Infant Milk Formulae by High-Performance Liquid Chromatography[J].Journal of Chromatography A,1997,778：243-246.

[5]ESCRIVA＇A.,ESTEVE M.J,FARRE＇R,FR＇IGOLA.A.Determination of Liposoluble Vitamins in Cooked Meals,Milk and Milk Products by Liquid Chromatography[J].Journal of Chromatography A,2002,94：7313–318.

[6]AKE M,FABRE H,MALAN AK,et al.Column Liquid Chromatography Determination of Vitamins A and E In Powdered Milk and Local Flour：A Validation Procedure[J].Journal of Chromatography A,1998,826：183-189.

[7]BERG H,TURNER C,DAHLBERG L,et al.Determination of Food Constituents Based on SFE：Applications to Vitamins A and E in Meat and Milk[J].Journal of Biochemical and Biophysical Methods,2000,43：391–401.

[8]TURNER C,MATHISSON L.Determination of Vitamins A and E in Milk Powder Using Supercritical Fluid Extraction for Sample Clean-Up[J].Journal of Chromatography A,2000,874：275-283.

[9]顏景超,湯水平,彭燦,等.反相高效液相色譜法快速測定嬰兒配方乳粉中的維生素A酯類化合物[J].食品科學(xué),2010,31（8）：154-157.

[10]李立平,廖青，崔景泰等.反相液相色譜法同時測定強化維生素奶制品中的VA酯和VE酯[J].食品科學(xué),1992,149（5）：54-58.

[11]GOMIS D.B,FERNA＇NDEZ M.P,GUTIE＇RREZ ALVAREZ M.D.Simultaneous Determination of Fat-Soluble Vitamins and Provitamins in Milk by Microcolumn Liquid Chromatography[J].Journal of Chromatography A,2000,891：109–114.

[12]RODAS M B,MORERA P S,CASTELLOTE A I,et al.Rapid Determination by Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography of Vitamins A and E in Infant Formulas[J].Journal of Chromatography A,2003,1018（2）：197-202.

[13]BLANCO D,FERN?NDEZ M.P,GUTI?RREZ M.D.Simultaneous Determination of Fat-Soluble Vitamins and Provitamins in Dairy Products by Liquid Chromatography with A Narrow-Bore Column[J].Analyst,2000,125：427–431.

[14]TURNER C,KING J W,MATHIASSON L.On-Line Supercritical Fluid Extraction/Enzymatic Hydrolysis of Vitamin A Esters：A New Simplified Approach for the Determination of Vitamins A and E in Food[J].J.Agric.Food Chem.2001,49：553-?558.

[15]TURNER C,PERSSON M,MATHIASSON L,et al.Lipase-Catalyzed Reactions in Organic and Supercritical Solvents：Application to Fat-Soluble Vitamin Determination in Milk Powder and Infant Formula[J].Enzyme and Microbial Technology,2001,29：111–121.

[16]DELGADO-ZAMARRENO M M,BUSTAMANTE-RANGEL M,GARCIA-JIMENEZ M,et al.Off-Line Coupling of Pressur-ized Liquid Extraction and LC/ED for The Determination of Retinyl Acetate and Tocopherols in Infant Formulas[J].Talanta,2006,70（5）：1094-1099.

[17]張戈,張虹,馬麗英.乳粉維生素A,D,E的高效液相色譜測定[J].哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2002,2：171-172.

[18]HEUDI O,TRISCONI M J,J BLAKE C.Simultaneous Quantification of Vitamins A,D3 and E in Fortified Infant Formulae by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry[J].Journal of Chromatography A,2004,1022：115-123.

[19]CH＇AVEZ-SERV＇INJL,CASTELLOTEAI,L＇OPEZSABATER M.C.Simultaneous Analysis of Vitamins A and E in Infant Milk-Based Formulae by Normal-Phase High-Performance Liquid Chromatography–Diodearray Detection Using A Short Narrow-Bore Column[J].Journal of Chromatography A,2006,1122：138–143.

[20]HEWAVITHARANA A.K,VANBRAKEL A.S,HARNETT M.Simultaneous Liquid Chromatographic Determination of Vitamins A,E and β-Carotene in Dairy Foods[J].International Dairy Journal,1996,6（6）：613-624.

[21]CHASE G.W,EITENMILLER R.R,Long A.R.Liquid Chromatographic Analysis of All-Rac-Α-Tocopheryl Acetate,Tocopherols,and Retinyl Palmitate in SMR 1846[J].Journal of Liquid Chromatography&Related Technologies,1997,20：3317-3327.

[22]WOOLLARD D.C,INDYK H.The Distribution of Retinyl Esters in Milks And Milk Products.[J].Journal of Micronutrient Analysis,1989,5：35-52.

[23]RODRIGO N,.ALEGRIA A,BARBERA R,etal.High-Performance Liquid Chromatographic Determination of Tocopherols in Infant Formulas[J].J.Chromatogr.A,2002,947：97-102.

[24]WYSS R,BUCHELI F.Determination Of Endogenous Levels of 13-Cis-Retinoic Acid（Isotretinoin）,All-Trans-Retinoic Acid（Tretinoin）And Their 4-Oxo Metabolites in Human and Animal Plasma by High-Performance Liquid Chromatography with Automated Column Switching And Ultraviolet Detection[J].J.Chromatogr.B,1997,700：31.-47

[25]COLIN F.POOLE.New Trends in Solid-Phase Extraction[J].Trends in Analytical Chemistry,2003,22：362-373

[26]NAHAR L,SARKER S D..Natural Products Isolation Methods in Biotechnology[M].,Humana press,Totowa NJ,2005,Volume 20,47-76.

[27]BARUA A B.,FURR H C..Properties of Retinoids.Structure,Handling,and Preparation[J].Molecular Biotechnology,1998 10：167-182,

[28]BRINKMANN E,DEHNE L,OEI H B,et al.Separation of Geometrical Retinol Isomers in Food Samples by Using Narrow-Bore High-Performance Liquid Chromatography[J].Journal of Chromatography A,1995,693：271-279.

[29]NOLL G N.High-Performance Liquid Chromatographic Analysis of Retinal and Retinol Isomers[J].Journal of Chromatography A,1996,721：247-259.

[30]NOLL G N.,BECKER C.High-Performance Liquid Chromatography of Non-Polar Retinoid Isomers[J].Journal of Chromatography A,2000,881：183–188.

Research advances in determining Vitamin A in dairy products by high-performance liquid chromatography

YAN Jing-chaoa,REN Guo-pua,AN Jingb,ZHANG Xiao-leia

（Faculty of Food Science and Engineering,Faculty ofLife Science and Technology,Central South University of Forestry and Technology,Changsha 410004,China）

This paper reviews recent advances in determining vitamin A in dairy products by high-performance liquid chromatography,which mainly focus on discussion of sample preparation,vitamin A separation and detection.In addition,the problems existing in research are briefly discussed.

Vitamin A;milk;milk powder;infant formula;high-performance liquid chromatography

TS252.7

B

1001-2230（2011）09-0043-04

2011-06-20

“十一五”國家科技支撐計劃課題（2006BAD04A15）。

顏景超（1987-），男，研究生，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。

任國譜