李 晨,黃 倢,謝國駟,趙 培,王秀華

(1.農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用重點開放實驗室中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所,山東青島266071;2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,上海200090)

3種水產(chǎn)病原菌簡型基因芯片檢測技術(shù)的建立*

李 晨1,2,黃 倢1**,謝國駟1,2,趙 培1,2,王秀華1

(1.農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用重點開放實驗室中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所,山東青島266071;2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,上海200090)

根據(jù)水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的3種病原菌鰻弧菌(Vibrio anguillarum)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)及遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)的研究資料,篩選3個毒力相關(guān)基因toxR、aerA、evpA設(shè)計引物和探針,構(gòu)建簡型基因芯片,并使用對蝦白斑病綜合征病毒(WSSV)variable region的PCR熒光標(biāo)記產(chǎn)物作為表面化學(xué)質(zhì)控。通過已構(gòu)建和優(yōu)化的多重PCR反應(yīng)條件,獲得了3個目的基因的PCR產(chǎn)物;經(jīng)過芯片制作過程的優(yōu)化,將探針以終濃度20μmol/L溶于50%DMSO,在室溫、相對濕度45%的條件下點印于醛基基片表面。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物與雜交液混合后,在42℃雜交2 h就可檢測到理想的雜交信號。芯片的靈敏度試驗結(jié)果表明,可以檢測到的3種水產(chǎn)病原菌的最低模板DNA為:鰻弧菌3×102拷貝、嗜水氣單胞菌5×103拷貝、遲緩愛德華氏菌6×101拷貝。該芯片可成功應(yīng)用于患病大菱鲆內(nèi)臟的細(xì)菌分離物的鑒定。

基因芯片;水產(chǎn)病原菌;檢測

基因芯片(Gene chip)又稱DNA芯片(DNA chip)、微陣列(Microarray),是1980年代產(chǎn)生,1990年代迅速發(fā)展起來的1種高科技手段,它具有高度并行性、高通量、微型化、自動化以及較高的靈敏度和直觀性等優(yōu)點[1],如今它已經(jīng)應(yīng)用于多種領(lǐng)域[2]。

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模的不斷擴(kuò)大和集約化程度的不斷提高,各種病害也接踵而至,給海水養(yǎng)殖生產(chǎn)造成了重大損失,將基因芯片技術(shù)應(yīng)用于水產(chǎn)病原微生物的鑒定、毒性分析等研究具有重要意義。美國學(xué)者Warsen等根據(jù)細(xì)菌16S rDNA設(shè)計寡核苷酸探針構(gòu)建基因芯片,對18種細(xì)菌進(jìn)行檢測,其中包括嗜水氣單胞菌、愛德華氏菌、葡萄球菌、鏈球菌等15種魚類常見病原菌,結(jié)果能100%特異性地檢測出這些病原菌[3];Georg Mitterer等根據(jù)23S rDNA設(shè)計特異引物和探針,建立固相PCR-芯片檢測技術(shù),可以檢測出多種葡萄球菌、大腸桿菌、假單胞菌等[4];日本水產(chǎn)綜合研究中心2005年成功開發(fā)出同時檢測38種魚類細(xì)菌的新技術(shù),其中包括20種淡水魚病原菌和18種海水魚病原菌[5];國內(nèi)學(xué)者李國軍等根據(jù)大腸埃希氏菌、傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌、李斯特氏菌等10種細(xì)菌的23S rDNA的高度保守和中間變異的特性,設(shè)計引物和探針,制備出可快速檢測臨床常見致病菌的寡核苷酸芯片[6]。另外基因芯片技術(shù)在水產(chǎn)食品中常見微生物的特異性檢測中也得到了應(yīng)用[7]。

由于基因芯片技術(shù)熒光標(biāo)記引物和氨基化探針合成、PCR擴(kuò)增、芯片點樣等方面成本顯著,很多情況下限制了基因芯片的應(yīng)用,基因芯片技術(shù)的精簡化在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域十分必要。鰻弧菌和遲緩愛德華氏菌是感染海水養(yǎng)殖魚類最常見的病原菌,嗜水氣單胞菌和遲緩愛德華氏菌是淡水養(yǎng)殖中最常見的病原菌,而鰻弧菌、嗜水氣單胞菌又是中國明對蝦及斑節(jié)對蝦主要的致病菌[8-9],建立可同時檢測這3種病原菌的基因芯片,可以以較低的成本對淡海水及半咸水的廣泛養(yǎng)殖區(qū)域的3種細(xì)菌性疾病進(jìn)行有效診斷。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步選擇3種病原菌穩(wěn)定而特異的毒力相關(guān)基因,不僅可以實現(xiàn)對3種病原菌的快速檢測,還可提供病原菌的毒力信息。基于此思想,本文針對上述3種病原菌,構(gòu)建基因芯片檢測技術(shù),嘗試開展簡化、低成本的基因芯片檢測技術(shù)的研究。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

鰻弧菌菌株ATCC43306購自美國標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所(American Type Culture Collection,ATCC);嗜水氣單胞菌、遲緩愛德華氏菌,均為本實驗室保種。

1.2 引物探針的設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中的鰻弧菌調(diào)控毒力蛋白表達(dá)的toxR基因、嗜水氣單胞菌編碼氣溶素的aerA基因、遲緩愛德華氏菌中編碼分泌系統(tǒng)裝置蛋白的evpA基因?qū)?yīng)的序列設(shè)計引物,篩選合適引物,再在同一條件下設(shè)計對應(yīng)的探針,注意排除各引物及探針間存在的發(fā)卡結(jié)構(gòu)、二聚體、交叉配對和錯配等情況。所設(shè)計的引物、探針及陽性質(zhì)控variable region的引物一起由Takara(寶生物有限公司)合成,并且在正向引物的5′端標(biāo)記HEX,探針3′端作氨基修飾。

1.3 細(xì)菌基因組DNA的提取

細(xì)菌基因組DNA提取采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(TIANamp bacteria DNA kit,北京天根生化科技有限公司)提取,并用基因分析儀(NanoDrop ND-2000c,美國NanoDrop)測定DNA濃度,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 多重PCR擴(kuò)增

利用已構(gòu)建并優(yōu)化的三重PCR體系[10],25μL PCR體系中含模板1.0μL,1.5 U ExTaq(5U/μL,Takara),1×ExTaqPCR buffer,2 mmol/L Mg2+,0.2 mmol/L dNTP。擴(kuò)增程序94℃4 min;94℃30 s,58℃30 s,72℃40 s,30個循環(huán);72℃10 min。分別以單一的鰻弧菌、嗜水氣單胞菌、遲緩愛德華氏菌的基因組DNA及3種細(xì)菌基因組DNA的混合物為模板進(jìn)行toxR、aerA、evpA基因片段的擴(kuò)增,產(chǎn)物用于芯片雜交試驗以測試探針的特異性。將3種細(xì)菌基因組DNA的混合物進(jìn)行101～1010倍梯度稀釋,并以此為模板進(jìn)行三重PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物用于測試芯片檢測的靈敏度。

1.5 芯片的制備

利用1.4中PCR體系及擴(kuò)增程序,不加Mg2+,并調(diào)整退火溫度到55.5℃,以WSSV的核酸為模板擴(kuò)增variable region產(chǎn)物。用二甲基亞砜(DMSO,Amresco)等比例稀釋探針toxR、aerA、evpA至終濃度20 μmol/L。利用Personal Arrayer 16點樣儀(Capital-Bio)將探針及variable regionPCR產(chǎn)物點印于醛基基片(CapitalBio)表面,點的直徑為0.15 mm,形成5×5方陣。每個子陣的布局為:1,QC1(variable region)×5;2,tox R×5;3,aerA×5;4,evpA×5;5,QC2(variable region)×5。按照醛基基片說明書進(jìn)行芯片的固定,37℃濕盒內(nèi)水合12 h以上,0.2%十二烷基硫酸鈉(SDS)洗滌,NaBH4溶液封閉5 min,清洗后離心甩干。

1.6 芯片的雜交及檢測

在雜交盒內(nèi)放入200μL的滅菌水,以保證雜交環(huán)境的濕度。將制備好的芯片貼上圍欄,放入雜交盒,蓋上蓋片,使整個小子陣都包含在1個雜交空間里。將多重PCR的產(chǎn)物與雜交液混合均勻后熱變性5 min,冰驟1 min,加入雜交空間里,裝好雜交盒,42℃雜交2 h。雜交體系為15μL,除PCR(混合)產(chǎn)物7μL外,還有20×saline sodium citrate(SSC)2.25μL、10%SDS 0.3μL、去離子甲酰胺3.75μL、50×Denhardt’s 1.5 μL。洗滌參照醛基基片說明書操作。離心甩干后,采用Luxscan 10K掃描儀(CapitalBio)檢測雜交結(jié)果,分辨率為10μm,該掃描儀的光電倍增管(PMT)是16位的,形成TIFF圖片的灰階是216,即最高信號值就是216-1=65535。各個點在532 nm處的信號值與周圍背景值之比是信噪比(Signal to Noise Ratio,SNR),SNR越大表示陽性信號越強(qiáng)。

1.7 芯片特異性和靈敏性的試驗

將1.4中得到的單一細(xì)菌的基因組DNA及3種細(xì)菌混合基因組DNA為模板的多重PCR產(chǎn)物,分別與雜交液混勻,加入子陣,用于檢驗探針的特異性;將1.4中各濃度梯度混合基因組DNA的多重PCR產(chǎn)物,分別與雜交液混勻,加入子陣,用于檢測芯片的靈敏性。芯片雜交及檢測過程同1.6。

1.8 患病大菱鲆內(nèi)臟組織中分離菌的鑒定

從某養(yǎng)殖場患病大菱鲆的內(nèi)臟組織中分離出的2株細(xì)菌,分別命名09071501、09071502,提取基因組DNA為模板,進(jìn)行多重PCR,體系及擴(kuò)增程序同1.4。擴(kuò)增產(chǎn)物一部分按照1.6中程序進(jìn)行芯片雜交試驗,另一部分送去Takara測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌基因組DNA的提取及3種基因目的產(chǎn)物的擴(kuò)增

成功提取了鰻弧菌、嗜水氣單胞菌、遲緩愛德華氏菌的基因組DNA,基因分析儀測定三者的核酸濃度分別為125.4、256和25.8 ng/μL。利用條件優(yōu)化后的多重PCR體系,成功擴(kuò)增出了3種特異性基因的目的片段及混合PCR產(chǎn)物,如圖1所示,3種目的產(chǎn)物分別為鰻弧菌的toxR368 bp、嗜水氣單胞菌aerA545 bp、遲緩愛德華氏菌evpA250 bp。

2.2 芯片上的固定及特異性檢驗

芯片固定后,掃描信號展示如圖2,亮點處為各子陣中表面化學(xué)質(zhì)控variable region的信號,由于2種產(chǎn)物的模板濃度不同而形成的信號強(qiáng)度不同,但數(shù)據(jù)表明質(zhì)控信號很好,說明芯片固定成功。

圖2 芯片固定后的信號展示及3種病原菌探針方陣的示意圖Fig.2 Displaying the signal after the chip fixed and diagram of probe square of three pathogens

探針特異性的檢驗結(jié)果如圖3所示,與單一細(xì)菌基因組DNA為模板的多重PCR產(chǎn)物雜交,結(jié)果分別在相應(yīng)地鰻弧菌探針tox R、嗜水氣單胞菌aerA、遲緩愛德華氏菌evpA位點處出現(xiàn)雜交陽性信號,而且很強(qiáng)。與混合基因組DNA為模板的多重PCR產(chǎn)物雜交后,相應(yīng)的3種探針位點處都為陽性信號,說明這些探針特異性良好,可以用于多重PCR產(chǎn)物的基因芯片檢測。

2.3 基因芯片檢測靈敏性的檢驗

利用圖像掃描得到的各個位點的信號值、背景值計算得到該點的SNR值,將所得數(shù)據(jù)形成折線圖,可以直觀地判斷出由多重PCR方法處理的樣品,用簡型基因芯片技術(shù)可以檢測到的最低限度是多少。

圖3 芯片上3種病原菌的探針特異性的檢驗結(jié)果Fig.3 Test results of probe specificity of three pathogens on chip

圖4 模板濃度未被稀釋的多重PCR產(chǎn)物與芯片雜交后的信號展示及信噪比折線圖Fig.4 Display signals and line chart of SNR after hybridized within products of m-PCR and chip while not diluted

如圖4所示為模板在未稀釋時的多重PCR產(chǎn)物與芯片雜交后的信號展示圖,其信噪比值很高,數(shù)據(jù)折線圖也說明3種信號都為陽性,而且evpA的信號最強(qiáng)。當(dāng)稀釋倍數(shù)增至104時,aerA基因5個信號值的信噪比中出現(xiàn)0點,因此將25.6 pg視為嗜水氣單胞菌的檢測閾值,根據(jù)摩爾常數(shù)公式計算出拷貝數(shù)為5×103,如圖5所示;同樣的方式判讀出對鰻弧菌toxR的檢測閾值是1.254 pg,即3×102拷貝;但很奇怪的是直到稀釋倍數(shù)增至106時,evpA基因的5個信號值的信噪比中才有0點出現(xiàn),懷疑有引物二聚體的影響。通過煮沸引物的方法抑制引物二聚體的形成,以消除其在芯片雜交中的影響,重復(fù)試驗后判定,遲緩愛德華氏菌最低檢測閾值是0.258 pg,即6×101拷貝。利用多重PCR方法處理樣品后,由此簡型基因芯片進(jìn)行檢測,檢測限比用1%瓊脂糖凝膠電泳查看PCR產(chǎn)物的方式,提高了至少10倍。

圖5 模板被稀釋104倍后的多重PCR產(chǎn)物與芯片雜交后的信號展示及信噪比折線圖Fig.5 Display signals and line chart of SNR after hybridized within products of m-PCR and chip while diluted 104times

2.4 患病大菱鲆內(nèi)臟組織中分離菌的鑒定

2種細(xì)菌的多重PCR產(chǎn)物與基因芯片雜交后的信號展示如圖6-1和圖6-2。圖6-1中,09071501的PCR產(chǎn)物與芯片上toxR探針雜交后出現(xiàn)陽性信號,而與其他2種探針沒有雜交信號;圖6-2中,09071502的PCR產(chǎn)物與芯片上3個特征基因的探針都沒有出現(xiàn)雜交信號。將兩者的測序結(jié)果在GenBank中BLAST,與09071501 PCR產(chǎn)物的測序序列同源的有3條序列:AY065624、AY042547及AJ299739,且都為鰻弧菌toxR基因序列,同源率為98%～99%,可以確定擴(kuò)增出的產(chǎn)物是鰻弧菌的toxR片段;09071502沒有測序結(jié)果。這2種細(xì)菌是實驗室謝國駟從某養(yǎng)殖場患病大菱鲆的內(nèi)臟組織內(nèi)分離出的,用16S rRNA片段測序、API細(xì)菌鑒定試劑條實驗的結(jié)果顯示09071501為鰻弧菌、09071502為交替假單胞菌,這與本研究中用基因芯片鑒定的結(jié)果相符,從而可以確定此患病大菱鲆內(nèi)臟組織中感染有鰻弧菌,用這種基因芯片檢測具有一定的特異性。

圖6 患病魚內(nèi)臟組織中病原菌的芯片檢測結(jié)果Fig.6 The microarray results of pathogens in visceral tissue of sick fish

3 討論

一般細(xì)菌檢測基因芯片的設(shè)計多采用細(xì)菌學(xué)上較保守的基因,比如被稱為細(xì)菌進(jìn)化的“活化石”16S rRNA基因及核糖體大亞單位23S rRNA等作為靶分子。但是16S rRNA和23S rRNA序列的保守性又是相對的,因為在此段序列上存在著每種細(xì)菌特異性的片段,就降低了rRNA用于鑒定和分類的精確度,所以特異性的靶分子有必要加入基因芯片的布局,用于病原菌的檢測或毒性分析。西班牙學(xué)者選用7種染色體上的特異性基因及2種質(zhì)粒上的特異性基因,通過多重PCR和短核苷酸探針構(gòu)建成DNA芯片,可同時檢測創(chuàng)傷弧菌、鰻弧菌、副溶血弧菌、殺鮭氣單胞菌等5種海水魚病原菌,靈敏度是瓊脂糖電泳的4倍[11];許拉等利用弧菌的特異性保守基因toxR特異性地區(qū)分出水體中副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、哈維氏弧菌和溶藻膠弧菌等主要水產(chǎn)病原菌[12];Panicker等用多重PCR和DNA芯片的方法可以靈敏地檢測和鑒定出墨西哥灣地區(qū)牡蠣的創(chuàng)傷弧菌、霍亂弧菌、副溶血弧菌[13]。

本試驗選擇鰻弧菌的保守基因toxR不僅可以調(diào)節(jié)毒力蛋白的表達(dá),而且具有一定的種特異性,重要的是在它在鰻弧菌的強(qiáng)毒株及弱毒株中都可以檢出[14];嗜水氣單胞菌的aerA作為其主要的毒力基因,已經(jīng)是該菌的快速診斷、流行病調(diào)查及公共衛(wèi)生檢測、檢疫等方面的重要標(biāo)準(zhǔn)[15-16];遲緩愛德華氏菌的毒力機(jī)制比較復(fù)雜,這里選擇的其中1個重要的分泌系統(tǒng)毒力蛋白編碼基因evpA[17]。另外本研究構(gòu)建的多重PCR體系不與弧菌屬的其他幾種弧菌、交替假單胞菌、對蝦的基因組DNA等有擴(kuò)增反應(yīng)[10],而且構(gòu)建的多重PCR-基因芯片不僅可用于3種病原菌的檢測,將檢測限提高至少10倍,還可用于它們的毒性分析,為臨床上的3種病原菌的檢測提供了一種可行的手段。

基因芯片檢測技術(shù)一方面可以代替測序?qū)CR產(chǎn)物進(jìn)行驗證,以排除PCR的假陽性[18];另一方面可以提高檢測的靈敏度,但是基因芯片還不能用于絕對定量。同時在構(gòu)建此簡型基因芯片的過程中,有些問題也凸顯出來,如引物和探針的設(shè)計、PCR擴(kuò)增、芯片的制備、雜交及雜交后的處理過程的各個環(huán)節(jié)都會影響基因芯片檢測技術(shù)的穩(wěn)定性及靈敏性。目前人們正在進(jìn)行更多種病原菌的平行檢測基因芯片技術(shù)的構(gòu)建,相信隨著技術(shù)的不斷跟進(jìn),研究的不斷深入,這些方面都將得到優(yōu)化,并最終形成一種完整的、精確的、穩(wěn)定的實用技術(shù)。

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Establishment of a Reduced Microarray for Detection of Three Aquatic Bacterial Pathogens

LI Chen1,2,HUANGJie1,XIE Guo-Si1,2,ZHAO Pei1,2,WAN G Xiu-Hua1
(1.Key Laboratory of Sustainable Utilization of Marine Fisheries Resources Certificated by the Ministry of Agriculture,Yellow Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Qingdao 266071,China;2.College of Fisheries and Life Science,Shanghai Ocean University,Shanghai 200090,China)

Based on the reported information of three major aquatic pathogensVibrio anguillarum,Aeromonas hy drophila,andEdwardsiella tarda,three primer pairs and oligo probes were designed against the genetoxR,aerAandevpAto construct a simple and convenient multiplex PCR-microarray.The gene variable regionof shrimp white spot syndrome virus(WSSV)was used as the surface chemistry quality control on the microarray.The target products which were amplified by multiplex PCR were hybridized to the microarray.The optimized preparation protocol employed an Aldehyde slide and 20μmol/L aminogroup DNA probes in 50%DMSO to be spotted on the slide at 45%humidity.The prepared microarray slide was hybridized with fluorescent PCR products at 42℃for 2 h.The overall LDLs(lowest detection level)of the microarray were tested with the genomic DNA of three bacterial strains around 3×102copies ofV.anguillarum,5×103copies ofA.hy drophila,and 6×101copies ofE.tarda.The technology was successfully demonstrated in the identification of bacterial isolates from a diseased turbot.

microarray;aquatic bacterial pathogens;establishment

S917

A

1672-5147(2011)03-037-06

農(nóng)業(yè)公益性行業(yè)科研專項(200803012);國家現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)(nycytx-46);國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃項目(2006AA100306);基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項資金項目(2007-GY-03)資助

2010-06-03;

2010-07-14

李 晨(1984-),女,碩士生。E-mail:lichen1010@sina.com

**通訊作者:E-mail:huangjie@ysfri.ac.cn

責(zé)任編輯 于 衛(wèi)