金利容，萬鵬，黃民松，黃薇，楊紹麗，喻大昭

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所，湖北 武漢430064）

棉花變黑輪枝菌的鑒定及致病性的測定

金利容，萬鵬，黃民松，黃薇，楊紹麗，喻大昭

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所，湖北 武漢430064）

自湖北棉區(qū)有黃萎病癥狀的棉葉中分離到能產(chǎn)生厚垣孢子的褐色菌，取2個(gè)供試菌株V12和V24，經(jīng)形態(tài)特征、生物學(xué)特性和ITS分析，鑒定為變黑輪枝菌（V.nigrescens）.對其致病性進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)其對棉花致病力極弱.推測該菌是一種植物衰老期或植物生長勢呈下降趨勢時(shí)的病原菌，常與大麗輪枝菌混生.

變黑輪枝菌；鑒定；致病性

1816年Nees von Esenbeck［1］建立了Verticillium屬，主要包括大麗輪枝菌（V.dahliaeKleb.）、黑白輪枝菌（V.albo－atrumReinke et Berth.）、變黑輪枝菌（V.nigrescensPethyhr.）、云狀輪枝菌（V.nubiliumPethybr.）和三體輪枝菌（V.tricorpusIsaac）.引起棉花黃萎病主要為大麗輪枝菌（V.dahliaeKleb.）.Pethybridge首次從英國馬鈴薯植株和塊莖中分離到兩種產(chǎn)生厚垣孢子的輪枝菌［2］，分別命名為變黑輪枝菌（V.nigrescensPethyhr.）和云狀輪枝菌（V.nubiliumPethyhr.）.1969年 Phillips從有褐莖腐病的大豆植株中分離到變黑輪枝菌［3］.據(jù)報(bào)道，變黑輪枝菌是棉花的弱致病菌，可使棉花輕度萎蔫發(fā)黃［4－6］.本研究室在湖北棉區(qū)分離到能產(chǎn)生厚垣孢子的褐色菌，經(jīng)形態(tài)特征、生物學(xué)特性和ITS分析結(jié)果鑒定為變黑輪枝菌.

1 材料和方法

1.1 菌株的采集、分離和純化供試樣本采集于湖北棉區(qū)，菌株分離于有黃萎病癥狀的棉葉葉柄.本試驗(yàn)共采用6個(gè)菌株，2個(gè)供試菌株：V12－1和 V24－1，由本實(shí)驗(yàn)室分離得到；2個(gè)變黑輪枝菌（V.nigrescens）對照菌株：V394和V43，由西北農(nóng)林科技大學(xué)胡小平老師提供，從苜蓿中分離得到；2個(gè)大麗輪枝菌（V.dahliae）對照菌株：V11和V991，V11由本實(shí)驗(yàn)室分離得到，V991由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)張獻(xiàn)龍老師提供.

分離采用組織保濕培養(yǎng)法，將棉株葉柄用自來水洗凈，用0.1%升汞處理30s，后用滅菌水清洗數(shù)次后用剪刀剪成小段，放在滅菌的玻片上保濕，25℃下恒溫培養(yǎng)，大約7d后在顯微鏡下觀察兩端是否有輪枝小梗，將其挑出并進(jìn)行純化，單孢分離.

1.2 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定將供試菌株和對照菌株接種于PDA平板上于25℃暗培養(yǎng)1周后進(jìn)行菌落觀察和鏡檢.挑取菌塊的少許，置于顯微鏡下觀察并用測微尺測量分生孢子和厚垣孢子的大小.將菌落用小刀切開，12～24h后觀察分生孢子梗的形態(tài).

將各菌株接種于查氏液體培養(yǎng)基，放入25℃恒溫?fù)u床上150r／min培養(yǎng)7d，觀察液態(tài)培養(yǎng)特性.

1.3 溫度對菌落生長的影響供試溫度：設(shè)置15、20、25、30、33、35℃ 共5個(gè)溫度.試驗(yàn)方法：用直徑為0.6cm的打孔器切取菌餅接種于PDA固體培養(yǎng)基上，分別置于上述6個(gè)不同溫度的恒溫箱內(nèi)暗培養(yǎng)，設(shè)3個(gè)重復(fù).觀察和記錄持續(xù)2周，第14天測量菌落直徑，用十字交叉平均法算出各菌株菌落的直徑.

1.4 菌株DNA的提取和核糖體ITS基因擴(kuò)增與測序

1.4.1 菌株DNA的提取 采用CTAB法［7］提取6個(gè)菌的菌株DNA.DNA電泳檢測.

1.4.2 ITS擴(kuò)增 用真核生物核糖體DNA通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增.其序列為，ITS1：5′－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3′，ITS4：5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′.

PCR反應(yīng)體系總體積為50μL，反應(yīng)液組分為：10×PCR Buffer 5μL，25mmol／L MgCl24μL，10 mmol／L dNTP 2μL，5U／μL Taq酶0.3μL，模板DNA 10ng，引物ITS1和ITS4（25μmol／L）各1μL，加ddH2O使總體積達(dá)到50μL，在PTC－100PCR擴(kuò)增儀上擴(kuò)增.擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性4min；94℃變性1min；54℃退火1min；72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min.PCR產(chǎn)物委托南京金斯瑞生物公司進(jìn)行純化和測序.

1.4.3 ITS序列分析 將6個(gè)菌株的核糖體DNA－ITS序列用DNAMAN軟件進(jìn)行同源性分析，并將這些菌株的測序序列與GenBank中已經(jīng)注冊的核酸數(shù)據(jù)庫中的ITS序列進(jìn)行同源性比較（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／blast），建立同源關(guān)系圖.

1.5 致病性測定

1.5.1 棉株的準(zhǔn)備 準(zhǔn)備無土基質(zhì)若干，于滅菌鍋中滅菌2h，滅菌后攤開晾干.將感病品種鄂棉24脫絨處理，取大約300粒棉種種入無土基質(zhì)中，待棉株長至1～2片真葉時(shí)待接種.

1.5.2 菌液的準(zhǔn)備 活化4個(gè)菌株V991、V11、V12－1和V24－1，在PDA上長至4d后在邊緣挑取少許菌絲接種于查氏培養(yǎng)基中，放入25℃恒溫?fù)u床上150r／min培養(yǎng)7d，用滅菌四層紗布過濾，用無菌水將孢子液濃度調(diào)整到1×107個(gè)／mL.

1.5.3 接種方法 待棉株長至1～2片真葉時(shí)將棉株從疏松的基質(zhì)中慢慢托起，以免傷到幼苗，從中選230株健康的棉苗，在4個(gè)不同菌株的菌液里各浸入50株苗子接種，接種時(shí)間為30min.其中30株浸到無菌水中，作為空白對照.接種30min后將棉苗重新種入到基質(zhì)中.將環(huán)境溫度控制在22～27℃，每2d澆一次水，保證苗子的濕度.每天觀察和記錄病害的發(fā)生情況，第15天、第20天、第25天和第30天調(diào)查發(fā)病率及病情指數(shù).以第30天調(diào)查的結(jié)果記錄發(fā)病情況并計(jì)算發(fā)病指數(shù).

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)學(xué)特征

2.1.1 菌落形態(tài) 各菌株固體培養(yǎng)基的形態(tài)：V12－1、V24－1和V43在PDA平板上培養(yǎng)初期為白色，1周左右后顏色開始慢慢變成褐色或者黑褐色，在菌落表面產(chǎn)生灰白色粉層，并有小顆粒狀的菌絲團(tuán)形成，邊緣整齊光滑.V394與前三者形態(tài)上一致，只是顏色要略深一點(diǎn)，為深褐色.V11和V991在PDA平板上培養(yǎng)初期為白色，后變?yōu)楹谏?，產(chǎn)生黑色微菌核，邊緣整齊，上面形成一層較薄的白色圈.

各菌株液體培養(yǎng)基的形態(tài)：V12－1、V24－1、V394和V43液體培養(yǎng)7d后在瓶壁上出現(xiàn)一圈淺紅色或者淺褐色的菌絲體，菌液中產(chǎn)生白色顆粒狀的菌絲團(tuán)，鏡檢發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)孢量較大.V11和V991液體培養(yǎng)7d后在瓶壁上會(huì)出現(xiàn)一層微菌核形成的黑色圈，菌液渾濁，未出現(xiàn)白色顆粒狀的菌絲團(tuán).

2.1.2 分生孢子梗的形態(tài) 6個(gè)菌株均能在切開的菌落邊緣產(chǎn)生大量形態(tài)一致的輪枝孢子梗，輪枝孢子梗的形態(tài)并無太大的差異，均能形成層次分明的輪枝，3～5層互生、對生或者輪生，多的可達(dá)8～10層，分生孢子有的位于輪枝孢子梗的頂端，呈圓形.有的散落出來，呈橢圓形，如圖1A.

從老菌落中挑取顏色較深的部分在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，供試菌株和V.nigrescens菌能產(chǎn)生厚垣孢子，這種厚垣孢子呈圓形、梨形、卵形或者不規(guī)則形，由細(xì)小菌絲聯(lián)接而成.位于基絲末端或中部，單生或幾個(gè)排列成短鏈，如圖1B.

圖1 顯微鏡觀測圖像（A：輪枝分生孢子，10×10倍；B：厚垣孢子，10×40倍）

用測微尺對各菌株的分生孢子和厚垣孢子的大小進(jìn)行測定，V11和V991不能產(chǎn)生厚垣孢子，其分生孢子略大些，兩個(gè)供試菌株和兩個(gè)V.nigrescens菌株能產(chǎn)生厚垣孢子，兩個(gè)供試菌株的厚垣孢子略大于兩個(gè)V.nigrescens菌，見表1.

2.2 溫度對各菌株生長的影響溫度試驗(yàn)表明，2個(gè)供試菌株和2個(gè)V.nigrescens菌在15～30℃在PDA上均能較好地生長，33℃下生長緩慢，在35℃仍略有生長，最適生長溫度約為25～28℃.兩個(gè)V.dahliae菌35℃停止生長，最適生長溫度約為23～25℃.對6個(gè)菌各個(gè)處理溫度的生長速率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，6個(gè)菌在各個(gè)溫度處理下的生長速度有一定的差異，同樣的溫度下兩個(gè)V.dahliae菌與其他4個(gè)菌有較為顯著的差異，見表2.

表1 各菌株分生孢子和厚垣孢子的大小

表2 不同溫度下生長14d后6個(gè)菌株的菌落直徑 cm

圖2 V11在不同溫度下的菌落形態(tài)（C：菌落背面，D：菌落正面）

2.3 ITS分析結(jié)果利用真核生物核糖體DNA通用引物ITS1和ITS4對這6個(gè)菌株的ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均得到約為500bp的片段，將擴(kuò)增產(chǎn)物送南京金斯瑞公司純化測序，將測序結(jié)果放到GenBank上查找，發(fā)現(xiàn)供試菌株和兩個(gè)V.nigrescens菌與已注冊的V.nigrescens有較高的同源性，而V11和V991則與已注冊的V.dahliae有較高的同源性.我們選取已注冊的V.nigrescensCBS 179.40 （GenBank No.EF543851）和V.dahliaeT9（GenBank No.AY555947）ITS序列，用DNAMAN軟件進(jìn)行同源性比對，建立同源關(guān)系圖.結(jié)果表明，T9、V991和V11有100%的同源性，V12－1、V24－1、V43、V394和CBS有100%的同源性.結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，判斷本實(shí)驗(yàn)室分離的2株供試菌株為變黑輪枝菌（圖4）.

2.4 致病性測定結(jié)果對2個(gè)供試菌和兩個(gè)V.dahliae菌進(jìn)行致病性測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2個(gè)供試菌株接種于棉花上并不表現(xiàn)有明顯的黃萎病癥狀，植株生長正常，不受抑制，僅有個(gè)別植株出現(xiàn)萎蔫；而V991和V11的第30天調(diào)查的病指分別為72.2和52.5，表現(xiàn)出較為明顯的黃萎病癥狀.

圖3 V24－1在不同溫度下的菌落形態(tài)（E：菌落背面，F(xiàn)：菌落正面）

3 討論

關(guān)于從棉花中分離到變黑輪枝菌，國內(nèi)的報(bào)道并不多見，陳吉棣在北京的茄子、馬鈴薯、利馬豆、菜豆、豇豆、茼麻、藜、葎草，黑龍江的茄子和河北的馬鈴薯等植物上首次分離到變黑輪枝菌［9］.王克榮等在我國江蘇省棉區(qū)分離到3個(gè)V.nigrescens菌株［10］.本研究室從湖北棉區(qū)采集的黃萎病病株中分離到能產(chǎn)生厚垣孢子的褐色輪枝菌，選取其中兩株，并結(jié)合兩個(gè)V.nigrescens菌和兩個(gè)V.dahliae菌，進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生物學(xué)特性及ITS序列分析，鑒定為變黑輪枝菌（V.nigrescens）.這是首次報(bào)道從湖北棉區(qū)分離到變黑輪枝菌.

從菌落形態(tài)上看，兩個(gè)供試菌株V12－1和V24－1的菌落顏色為褐色，其休眠結(jié)構(gòu)并不是黑色的微菌核，而是菌絲聯(lián)接在一起的厚垣孢子，商鴻生等認(rèn)為菌絲休眠體的形態(tài)是區(qū)分各近似種的重要形態(tài)鑒別特征［11］.V12－1和 V24－1的分生孢子的大小與兩個(gè)V.nigrescens菌的大小相當(dāng)，但略小于兩個(gè)V.dahliae菌.而兩個(gè)供試菌株厚垣孢子的大小比兩個(gè)V.nigrescens菌要大些，據(jù)報(bào)道，不同地區(qū)分離的V.nigrescens菌的分生孢子和厚垣孢子的大小數(shù)值并不是完全一致［12－14］.在溫度試驗(yàn)中，V12－1、V24－1和兩個(gè)V.nigrescens菌33℃生長良好，35℃邊緣仍有少許生長，而兩個(gè)V.dahliae菌35℃不生長.將ITS擴(kuò)增序列用軟件進(jìn)行同源性比對，V12－1和V24－1的ITS序列與V.nigrescens同源性很高，達(dá)到100%.

致病性測定結(jié)果表明，V12－1和V24－1對棉花的致病性很弱，且對植株生長影響也不大，這與王克榮等的結(jié)果是一致的.V12－1和V24－1是9月初從典型的黃萎病棉株中分離得到的，陳吉棣［9］指出，主要在植物后期分離到變黑輪枝菌，大多與大麗輪枝菌混生.我們可以認(rèn)為該菌是一種植物衰老期或植物生長勢呈下降趨勢時(shí)的病原菌，由于其通常與大麗輪枝菌混生，較難分離到.雖然V12－1和V24－1對苗期棉花不具致病力或致病力極弱，但是否會(huì)對棉花后期造成影響，還需要進(jìn)一步的研究.

圖4 同源關(guān)系圖

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Indentification and pathogenicity determination of isolates ofVerticilliumnigrescensPethybr

JIN Lirong，WAN Peng，HUANG Minsong，HUANG Wei，YANG Shaoli，YU Dazhao
（Institute of Plant Protection and Soil Science，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064，China）

V12and V24，two isolates ofVerticilliumwith brown chlamydospores，isolated from cotton growing regions in Hubei，were identified asVerticilliumnigrescensbased on morphology，biological characters and ITS analysis.Inoculating cotton in greenhouse，we found that the pathogenicity of both the two isolates was very weak to cotton.It was speculated that the isolates were a kind of pathogen parasitizing on the stage of plant senescence，or plant in downward trend.And it was often mixed withV.dahliae.

VerticilliumnigrescensPethybr；indentification；pathogenicity

S435

A

1000－2375（2011）04－0413－05

2011－03－30

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（nyhyzx07－052）和國家科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)（SB2007FY027）資助

金利容（1982－），女，助理研究員；喻大昭，通信作者，研究員，E－mail：dazhaoyu＠china.com

（責(zé)任編輯 游俊）