張錦明,王武尚,張曉軍,郭 喆,田嘉禾

1.中國人民解放軍總醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科,北京 100853;

2.西北核技術(shù)研究所,陜西西安 710024

Aβ斑塊顯像劑:11C-PIB的合成及標(biāo)記

張錦明1,王武尚2,張曉軍1,郭 喆1,田嘉禾1

1.中國人民解放軍總醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科,北京 100853;

2.西北核技術(shù)研究所,陜西西安 710024

11C標(biāo)記2-(4′-N-11C-甲胺基苯)-6-羥基苯并噻唑(6-OH-BTA-1)是目前較理想的Aβ斑塊顯像劑,本研究合成了6-OH-BTA-1的前體:6-羥基-2-(4′-氨基苯基)苯并噻唑,并用11C標(biāo)記。在常溫下,無需保護羥基條件下,標(biāo)記效率為52.6%(校正,n=35),產(chǎn)品放射化學(xué)純度大于99%,比活度為18.0 TBq/mmol。80℃加熱2 min,有副反應(yīng)發(fā)生。采用弱酸性流動相,半制備 HPLC分離后產(chǎn)品的放射化學(xué)純度達99%。

Aβ斑塊顯像劑;阿爾茨海默病(AD);11C-PIB

阿爾茨海默病(Alzheimer’s,AD)病理學(xué)特征包括神經(jīng)元喪失、神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFT)、老年斑(Aβ斑塊)和神經(jīng)元內(nèi)顆?？张葑冃?。病理學(xué)檢測Aβ斑塊的染色劑有:剛果紅(Congo red,CR)、硫磺素-T(thioflavin-T)、硫磺素-S、金黃胺G(chrysamine G,CG)和 X-34等,這些試劑在體外與Aβ有很高的親和能力。如果用放射性核素標(biāo)記上述試劑或類似物,并能有效突破血腦屏障(BBB)進入大腦,就可以采用 SPECT或PET技術(shù),進行AD患者腦內(nèi)老年斑分布及定量的在體、可視化檢測,可以提高AD的早期診斷率和鑒別準(zhǔn)確率,而且可以對AD病人分期、針對Aβ為靶點的治療和藥物的研究等提供有效的評價方法。文獻報道了多種在體顯示AD患者腦內(nèi) Aβ-淀粉樣蛋白沉積顯像劑,如18F標(biāo)記的甲氧萘普酸(FDDNP)類[1]、123I標(biāo)記 IMPY、11C標(biāo)記的苯二烯[2-3]和18F-AV45[4]等。其中2-(4′-N-11C-甲胺基苯)-6-羥基苯并噻唑(N-11CH3-6-OH-BTA-1,習(xí)慣稱11C-PIB)是一類較理想的Aβ顯像劑,其脂溶性適中,lgP=1.2,與Aβ1-40聚集物有很高的親和常數(shù)(Ki=4.3 nmol/L),在正常小鼠腦內(nèi)清除很快,2 min/30 min腦攝取比達到12[5]。本工作擬在文獻基礎(chǔ)上合成前體6-OH-BTA-0,并研究不同制備和分離條件對11C-PIB標(biāo)記率及放化純度的影響。

1 試劑和儀器

2-氨基-6-甲氧基苯并噻唑、對硝基苯甲醛,純度均大于98%,美國Alfa Aesar公司;柱層析硅膠,青島海洋化工集團公司;1 mol/L LiAlH4/THF和 PIB標(biāo)準(zhǔn)品,德國 ABX公司;57%HI,美國Sigma公司;其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

Necolet-170SX傅立葉紅外儀,美國Necolet公司;Avance 500 MHz核磁共振儀,美國Bruker公司;TrisGC2000質(zhì)譜儀,美國 Finnigan公司;Perkin-Elmer 240-C型元素分析儀,美國 PE公司;XT4顯微熔點測定儀,北京泰克儀器有限公司,溫度未校正。Sumitomo HM-20S回旋加速器,日本駐友公司;C-11碘代甲烷合成器和多功能碳-氟一體機,北京派特生物技術(shù)有限公司;高效 HPLC分析儀,美國 Waters公司,配515泵、2487紫外檢測器、BioScan流動放射性檢測器。

2 實驗方法

2.1 6-羥基-2-(4′-氨基苯基)苯并噻唑的合成

以2-氨基-6-甲氧基苯并噻唑為起始原料,根據(jù)文獻[6-7]合成了中間體5-甲氧基-2-氨基苯硫酚。然后依照文獻[8]合成6-甲氧基-2-(4′-硝基苯基)苯并噻唑,將硝基還原成氨基,得6-甲氧基-2-(4′-氨基苯基)苯并噻唑(6-MeO-BTA-0),再去甲基化后得到目標(biāo)化合物。合成路線示于圖1。

圖1 6-OH-BTA-0的合成線路圖及其11C標(biāo)記Fig.1 Scheme for synthesis of 6-OH-BTA-0 and its11C-labeling to produce11C-PIB

2.1.1 5-甲氧基-2-氨基苯硫酚(1)的合成 反應(yīng)瓶中加入2.7 g(15.0 mmol)2-氨基-6-甲氧基苯并噻唑、16.2 g KOH、32 mL水,加熱回流12 h。反應(yīng)液冷卻至室溫,加入15 mL水,過濾除去不溶物。攪拌下向濾液中加入36%乙酸至微酸性,置于冰箱冷卻。抽濾,水洗沉淀(10 mL×3)。50℃下干燥,得黃色粗產(chǎn)物5-甲氧基-2-氨基苯硫酚1.7 g。

2.1.2 6-甲氧基-2-(4′-硝基苯基)苯并噻唑 (2)的合成 反應(yīng)瓶中加入5-甲氧基-2-氨基苯硫酚1.7 g、對硝基苯甲醛1.7 g(11.2 mmol)和15 mL DMSO。攪拌,加熱至近沸,反應(yīng)1 h。冷卻至室溫,加入25 mL水,攪拌,抽濾,水洗沉淀(15 mL×3)。沉淀于110℃下干燥,乙酸乙酯重結(jié)晶1次 ,得黃色 6-甲氧基-2-(4′-硝基苯基)苯并噻唑2.0 g。

2.1.3 6-甲氧基-2-(4′-氨基苯基)苯并噻唑 (3)的合成 反應(yīng)瓶中加入6-甲氧基-2-(4′-硝基苯基)苯并噻唑 2.0 g(7.1 mmol)、SnCl2·2H2O 4.0 g(17.7 mmol)和60 mL無水乙醇。攪拌下加熱回流5 h。反應(yīng)液冷卻至室溫,旋蒸除去無水乙醇,用200 mL乙酸乙酯溶解殘余物,溶液轉(zhuǎn)入分液漏斗中,用1 mol/L NaOH洗滌(150 mL×3),水洗至中性。旋蒸除去溶劑,用硅膠柱層析分離(V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)=60∶40),得淡黃色6-MeO-BTA-0 1.5 g,總產(chǎn)率 40%,熔點 192～193℃。

2.1.4 6-羥基-2-(4′-氨基苯基)苯并噻唑(4)的合成 反應(yīng)瓶中加入6-甲氧基-2-(4′-氨基苯基)苯并噻唑0.71 g和200 mL二氯甲烷,冰浴冷卻,滴加28.4 mL 1 mol/L BBr3的二氯甲烷溶液,升溫至室溫,攪拌反應(yīng)過夜,冰浴冷卻,加入100 mL水,用1 mol/L NaOH中和,用200 mL乙酸乙酯分2次萃取,合并有機相,水洗(50 mL×3),無水硫酸鈉干燥,旋蒸除去溶劑,用硅膠柱層析分離(V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)=50∶50),得淡黃色6-OH-BTA-0 0.6 g,產(chǎn)率83%。

2.2 碳-11碘代甲烷的生產(chǎn)及三氟甲基磺?；?Triflate)的在線轉(zhuǎn)換

用Sumitomo HM-20S回旋加速器,40μA 20 MeV質(zhì)子轟擊含1%氧的天然氮氣靶,通過14N(pα,)11C核反應(yīng)生成11C-CO2。[11C]-CH3I由單管、液相法由碳-11碘代甲烷儀自動化合成[9],即生成的11C-CO2由液氮捕獲后,由氮氣以30 mL/min速率載帶入0.2 mL 1 mol/L氫化鋰鋁/THF中,然后加熱除 THF,加入0.2 mL 57%的氫碘酸,生成的11C-CH3I由氮氣載帶,通入Triflate轉(zhuǎn)化爐,11C-CH3I在線轉(zhuǎn)化成11C-CH3-Triflate[10]。

2.3 11C-PIB(5)的標(biāo)記及純化

1.0mg的6-OH-BTA-0前體,用0.2 mL丙酮溶解,安裝于多功能碳-氟一體機。將上述制備的11C-CH3-Triflate通入該溶液,常溫下反應(yīng)。當(dāng)碳-氟一體機上放射性計數(shù)達到最大、不再增加時,80℃加熱2 min或不加熱直接用2 mL 55%的乙腈溶液稀釋后自動進入半制備的 HPLC純化,流動相為φ=55%的乙腈水溶液,流速為6 mL/min,半制備柱為 GraceAlltimaC-18 HPLC柱(10 mm×250 mm),收集6～7 min時的放射性峰,再用60 mL水混和,混和液過 C-18柱,用10 mL水清洗該柱,最后用1.0 mL無水乙醇將產(chǎn)品從C-2柱上洗脫,加入9 mL水。

2.4 11C-PIB質(zhì)量控制

采用 HPLC分析產(chǎn)品的放化純度,分析柱為Grace Alltima C-18,5μm,3.9 mm ×150 mm,流動相為φ=50%MeCN水溶液,流速為1 mL/min。產(chǎn)品的保留時間為6.8 min。

將德國ABX公司的PIB標(biāo)準(zhǔn)品配成不同濃度,HPLC進相同體積樣,測量6.8 min處的紫外吸收峰,以紫外吸收峰面積對 PIB濃度作圖得標(biāo)定直線,從相同體積樣品在6.8 min處的紫外吸收峰面積計算樣品中12C-PIB的濃度,再根據(jù)放射化學(xué)濃度,計算產(chǎn)品11C-PIB的比活度。

3 結(jié)果和討論

(1)本研究所合成的前體是未保護羥基的6-OH-BTA-0,最終產(chǎn)品的紅外光譜圖:3 458.4、3 284.8、1 315.5、602.8、1 465.9、1 437.0 cm-1。1H NMR(500 MHz,acetone-d6,δ):7.796 48～7.813 73(d,J=8.63 Hz,3H),7.534 65～7.539 49(d,J=2.42 Hz,1H),7.061 85～7.084 52(m,1H),6.781 63～6.798 67(d,J=8.52 Hz,2H),3.889 71(s,3H),2.975 42(s,2H)。MS(EI)m/z:256.07(M+),257.07(M++1)。元素分析的計算值 C、65.60%,H、4.719%,N、10.93%;實驗值 C、65.72%,H、4.885%,N、10.97%。

合成化合物1時,由于中和強堿,生成了大量的乙酸鈉,需在第二步中用大量水洗的方法除去。同時化合物1不穩(wěn)定,合成當(dāng)天將之轉(zhuǎn)化成產(chǎn)品2。產(chǎn)品3還原后,溶液中含有的乙醇對乙酸乙酯的萃取不利,使乙酸乙酯與水成混合相,因此必須采用蒸發(fā)法將之除去,以保證乙酸乙酯萃取成功。

(2)在常溫、中性條件下、無需保護羥基,11CCH3-Triflate很容易與前體發(fā)生反應(yīng),標(biāo)記效率為52.6%(校正,n=35),而且100%是在苯胺上C—N甲基化(圖2(a)),半制備 HPLC的放射性曲線表明,tR=2.5 min處為未反應(yīng)的放射性,5.8 min處為標(biāo)記物,收集該峰,經(jīng)固相萃取得到最終產(chǎn)品。

前體中通入11C-CH3-Triflate,并在80℃加熱2min。從圖2(b)可以發(fā)現(xiàn),加熱后的標(biāo)記率沒有上升,同時發(fā)現(xiàn)在約11.3 min處多了一個峰,收集該峰,HPLC分析表明該峰為6-11C-甲氧基-2-(4′-氨基苯基)苯并噻唑(標(biāo)準(zhǔn)物為合成物質(zhì)3),即在6位羥基上發(fā)生了C—O甲基化,該比例約占10%左右。

圖2 半制備 HPLC分離的放射性曲線Fig.2 Radioactivity profiles of semiprep HPLC with different reaction temperature

11C-PIB的標(biāo)記方法很多,一種方法是采用11C-CH3I,在堿性條件下標(biāo)記,但此時的前體6位羥基需保護,以防止生成甲氧基(6-MeO-BTA-0);然后再脫保護;該方法標(biāo)記時間長,步驟多,標(biāo)記率低[11]。其后采用 6-OH-BTA-0作前體,采用11C-CH3-Triflate在無保護條件下甲基化,標(biāo)記的方法有LOOP法、反應(yīng)管法(溶劑分別是甲乙酮和丙酮)[11-13],LOOP法無需加熱,反應(yīng)管法采用80℃加熱1 min方法,標(biāo)記效率最高到44%,未觀察到副反應(yīng)的發(fā)生[14]。但本研究進一步研究發(fā)現(xiàn),加熱時間短(1 min內(nèi)),基本觀察不到副反應(yīng),但延長加熱時間后明顯有副反應(yīng)。

(3)半制備 HPLC采用流動相為φ=55%乙腈水溶液-φ=0.2%冰乙酸,最終產(chǎn)品 HPLC分析表明,產(chǎn)品放射化學(xué)純度大于99%,比活度為18.0 TBq/mmol(圖3(a))。但半制備 HPLC流動相為φ=55%乙腈水溶液,最終產(chǎn)品的放射化學(xué)純度在95%～98%(圖3(b)),能明顯觀察到2個小的雜質(zhì)峰?？梢姴煌琾 H的半制備 HPLC流動相,最終產(chǎn)品的放射化學(xué)純度有一定區(qū)別,弱酸性的流動相有助于將雜質(zhì)除去。因為反相C-18柱的分離條件與p H關(guān)系很大,弱酸性的流動相提高了半制備反相C-18柱的分離能力。

圖3 產(chǎn)品11C-PIB的 HPLC質(zhì)控圖Fig.3 Analytical HPLC profiles of11C-PIB after semiprep HPLC

文獻上半制備 HPLC的流動相變化不大,主要是乙腈與水的混合液;為調(diào)節(jié)pH,有采用0.1 mol/L碳酸氫銨[11,14],也有采用 0.2%三乙胺乙酸鹽[13],這些流動相制備的產(chǎn)品放射化學(xué)純度在95%～98%[11-13],有時甚至低于95%,為不合格產(chǎn)品。采用弱酸性半制備流動相,則明顯將雜質(zhì)除去,提高了產(chǎn)品的放射化學(xué)純度。

4 結(jié) 論

11C-PIB是較理想的 Aβ斑塊顯像劑,適于AD患者的診斷與療效評價。本研究合成了未保護羥基的前體:6-羥基-2-(4′-氨基苯基)苯并噻唑,并用11C-CH3-Triflate在常溫中性條件下標(biāo)記,標(biāo)記效率為52.6%(校正,n=35),比活度為18.0 TBq/mmol。采用弱酸性半制備流動相,產(chǎn)品的放射化學(xué)純度大于99%。

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Synthesis and Carbon Labeling of11C-PIB for Aβ-Amyloid Imaging

ZHAN GJin-ming1,WANG Wu-shang2,ZHANG Xiao-jun1,GUO Zhe1,TIAN Jia-he1

1.Department of Nuclear Medicine,The PLA General Hospital,Beijing 100853,China;
2.Northwest Institute of Nuclear Technology,Xi’an 710024,China

Assessing the deposition of Aβ-amyloid in the living brain is important for diagnosis and treatment ofAlzheimer’s disease(AD).2-(4′-N-11C-methyl-aminophenyl)-6-hydroxybenzothiazole(11C-PIB)was used as a ideal labeled probe imaging Aβ-amyloid for AD.The precursor of11C-PIB,2-(4′-aminophenyl)-6-hydroxybenzothiazole,was synthesized.11C-PIB was labeled with11C-CH3-Triflate(Trifluoromethanesulfonate)under unprotect 6-hydroxyl precursor at room temperature.The labeling yield,radiochemistry purity and specific activity are 52.6%(corrected,n=35),99%and 18.0 TBq/mmoL respectively.The by-reaction occurrs when the reaction is heated 80℃for 2 min.The radiochemistry purity can be improved to 99%by semi-HPLC weak acid mobile phase.

Aβ-amyloid imaging agent;AD;11C-PIB

R817.4

A

0253-9950(2011)03-0188-05

2010-06-04;

2010-12-07

國家自然科學(xué)基金資助項目(30670586);核能開發(fā)科技資助項目(2009-1228)

張錦明(1965—),男,江蘇南通人,博士,研究員,核醫(yī)學(xué)專業(yè)