黃 苛, 劉祝祥, 陳奇輝, 賀建武, 粟 銀, 張 麗, 陳義光

(吉首大學(xué) 植物資源保護(hù)與利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 湖南 吉首 416000)

海膽相關(guān)菌株抗菌活性篩選及其生物學(xué)特性

黃 苛, 劉祝祥, 陳奇輝, 賀建武, 粟 銀, 張 麗, 陳義光

(吉首大學(xué) 植物資源保護(hù)與利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 湖南 吉首 416000)

以8個(gè)菌株(3株革蘭氏陽(yáng)性菌、3株革蘭氏陰性菌和2株真菌)作為指示菌, 采用管碟法對(duì)分離自南海硇洲島馬糞海膽(Hemicentrotus pulcherrimus)中的106株細(xì)菌(含放線菌)進(jìn)行抗菌活性篩選, 并對(duì)其中抗菌活性較強(qiáng)的菌株進(jìn)行了基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析和生物學(xué)特性研究。結(jié)果顯示, 具有抗菌活性的細(xì)菌59株, 占受試菌株總數(shù)的55.7%。綜合分析形態(tài)特征、生理生化特征和基于 16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析數(shù)據(jù), 結(jié)果表明, 10株具有較強(qiáng)抗菌活性的菌株分別屬于Halobacillus屬(JSM 076029、JSM 076017、JSM 076062),Bacillus屬(JSM 076053、JSM 076009),Pontibacillus屬(JSM 076056),Planococcus屬(JSM 076050),Jeotgalibacillus屬(JSM 076100),Salinicoccus屬(JSM 076102)和Serratia屬(JSM 076077)。

海膽相關(guān)細(xì)菌; 抗菌活性; 生物學(xué)特性; 系統(tǒng)發(fā)育

由于海洋環(huán)境的多樣性和特殊性, 其微生物無(wú)論是物種類(lèi)群, 還是新陳代謝途徑、生理生化類(lèi)型與次生代謝產(chǎn)物等, 都存在著豐富的新穎性和多樣性,因而蘊(yùn)藏的新資源更為豐富和多樣化[1-3]。海洋微生物具有產(chǎn)生大量新型天然活性物質(zhì)的潛力, 但相應(yīng)的研究開(kāi)發(fā)工作尚處于初級(jí)階段, 其代謝產(chǎn)物被篩選的僅約為 1%[4]。海洋中的微生物分布非常廣泛,它們有的自由生活在海水中, 有的存在于一些海底沉積物或海泥的表面, 還有一部分與海洋動(dòng)植物處于共生、共棲、寄生或附生的關(guān)系。越來(lái)越多的研究也表明, 海洋微生物, 尤其是那些跟海洋動(dòng)物或海洋植物存在附生、共生或寄生等關(guān)系的相關(guān)微生物, 能產(chǎn)生一些結(jié)構(gòu)獨(dú)特并具強(qiáng)烈生理活性的代謝產(chǎn)物[5]。Bernan等[6]的研究結(jié)果顯示, 自由海水中活性菌株篩得率為 10%, 海洋底泥為 27%, 海洋動(dòng)植物相關(guān)微生物高達(dá) 48%。由此可見(jiàn), 從海洋動(dòng)植物相關(guān)微生物的代謝產(chǎn)物中分離篩選新活性物質(zhì)的可能性要更高。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn), 部分以前被認(rèn)為是海洋動(dòng)植物產(chǎn)生的重要生物活性物質(zhì), 實(shí)際上是由這些動(dòng)植物的相關(guān)微生物所產(chǎn)生的[7-9]。海洋無(wú)脊椎動(dòng)物產(chǎn)生的大量結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物, 因具有獨(dú)特的生物活性已被應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)研究和臨床[10], 但是直接從海洋無(wú)脊椎動(dòng)物來(lái)提取這些化合物存在供應(yīng)量低、價(jià)格昂貴的問(wèn)題。所以, 從海洋無(wú)脊椎動(dòng)物中分離這些能產(chǎn)生化合物的微生物具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)室近年來(lái)開(kāi)展了南海低等動(dòng)物相關(guān)微生物資源與生態(tài)方面的系列研究, 發(fā)現(xiàn)南海低等動(dòng)物相關(guān)微生物的多樣性高, 潛藏著較多的新類(lèi)群, 且具有較高比例的菌株能產(chǎn)生抗菌、抗癌等生物活性物質(zhì)[11-12]。本文報(bào)道了對(duì)分離自南海硇洲島海域馬糞海膽(Hemicentrotus pulcherrimus)的相關(guān)細(xì)菌(含放線菌)的抗菌活性篩選及部分陽(yáng)性菌株的生物學(xué)特性研究結(jié)果, 以期為海膽相關(guān)微生物資源的開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

引物由北京三博遠(yuǎn)志生物有限責(zé)任公司合成,其他試劑同文獻(xiàn)[13]。

1.1.2 菌株來(lái)源

用于本次抗菌活性篩選用的實(shí)驗(yàn)菌株共 106株細(xì)菌(含放線菌), 分離自湛江硇洲島海域的馬糞海膽樣品[11], 保存于吉首大學(xué)微生物資源與生態(tài)實(shí)驗(yàn)室。用于抗菌活性篩選的8株敏感指示菌(3株革蘭氏陽(yáng)性菌、3株革蘭氏陰性菌和 2株真菌)由吉首大學(xué)微生物資源與生態(tài)實(shí)驗(yàn)室提供, 分別為： 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、藤黃八疊球菌(Sarcina lutea)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、產(chǎn)氣桿菌(Enterobacter aerogenes)、大腸桿菌(Escherichia coli)、變形桿菌(Proteus vulgaris)、黑曲霉(Asperillus niger)和白色念珠球菌(Candida albicans)。

1.1.3 培養(yǎng)基

(1)斜面種子培養(yǎng)基： NaCl 19.45 g, MgCl25.9 g,Na2SO43.24 g, CaCl21.9 g, 蛋白胨5 g, 酵母膏1 g,復(fù)合鹽A液(KCl 27.5 g, Na2CO38 g, Ferric Citrate 5 g,水1 000 mL)20 mL, 復(fù)合鹽B液(SrCl34 g, KBr 80 g,H3BO322 g, Na2SiO34 g, (NH4)2SO41.6 g, Na2HPO48 g, 水1 000 mL)1 mL, 瓊脂20 g, 水1 000 mL, pH 7.5;(2)液體種子培養(yǎng)基： 葡萄糖15 g, 甘露醇5 g, 蛋白胨10 g, 牛肉膏2 g, CaCO31 g, NaCl 20 g, 其他成分同斜面培養(yǎng)基, 不加瓊脂; (3)發(fā)酵培養(yǎng)基： 葡萄糖20 g, 蛋白胨5 g, 大豆粉5 g, 酵母膏1 g, NaCl 20 g,CaCO31 g, 復(fù)合鹽A液20 mL, 復(fù)合鹽B液1 mL,水 1 000 mL, pH 7.5; (4)營(yíng)養(yǎng)瓊脂(nutrient agar, NA)：牛肉膏5 g, 蛋白胨10 g, NaCl 5 g, 瓊脂20 g, 水1 000 mL, pH 7.5。

1.2 抗菌活性初篩

刮取一支成熟的斜面菌體, 接種于裝有 80 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中, 200 r/min, 28°C培養(yǎng)96 h, 3個(gè)重復(fù)。發(fā)酵液4 000 r/min離心10 min, 取上清液, 用于抗菌活性測(cè)定。

1.3 抗菌活性復(fù)篩

采用復(fù)發(fā)酵法進(jìn)行菌株發(fā)酵： 先培養(yǎng)液體搖瓶種子培養(yǎng)基, 250 mL三角瓶裝種子培養(yǎng)基50 mL, 按一支斜面孢子或菌體接一瓶種子瓶的量把斜面種子接到液體種子培養(yǎng)基中, 28℃, 200 r/min振蕩培養(yǎng)48 h,得到種子液; 再用此種子液按 10%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中, 按1.2所述方法進(jìn)行發(fā)酵和發(fā)酵液制備。

1.4 抗菌活性測(cè)定

采用管碟法[14]測(cè)定發(fā)酵液抗菌活性。每管加樣20 μL, 每樣重復(fù)3次, 28°C培養(yǎng)48 h, 測(cè)抑菌圈直徑。

1.5 基于 16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

基因組DNA的提取、16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物的純化及對(duì)純化后的產(chǎn)物測(cè)序均按崔曉龍等[15]使用的方法進(jìn)行(測(cè)序過(guò)程由寶生物公司完成)。擴(kuò)增和測(cè)序用一對(duì)細(xì)菌通用引物： 正向引物PA(8-27f： 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和反向引物 PB(1523-1504r： 5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)。所得序列提交 GenBank注冊(cè), 獲取序列號(hào)。根據(jù)測(cè)序結(jié)果, 用Blast搜索軟件從GenBank、EMBL和 DDBJ等公共數(shù)據(jù)庫(kù)中調(diào)出相似性較高的相關(guān)菌株的16S rRNA基因序列, 用CLUSTAL X[16]進(jìn)行多序列比對(duì), 并用MEGA 4.0(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)軟件包采用鄰接法(Neighbor-Joining)進(jìn)行聚類(lèi)分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[17], 以重復(fù)1 000次自展(bootstrap)法檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)各分支的置信度[18]。

1.6 生物學(xué)特性

按照文獻(xiàn)[19]的方法進(jìn)行形態(tài)特征、培養(yǎng)特征和生理生化特征實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 抗菌活性篩選

2.1.1 初篩

用管碟法對(duì)分離出的 106株菌株進(jìn)行了抗菌活性初篩, 統(tǒng)計(jì)發(fā)酵液至少對(duì) 1株指示菌有抗菌活性的菌株, 發(fā)現(xiàn)有59株的發(fā)酵產(chǎn)物具有不同程度的抗菌活性, 占受試菌株的55.7%。具體結(jié)果統(tǒng)計(jì)如表1。

表1 海膽分離菌株抗菌活性篩選結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Tab. 1 Results of antimicrobial tests of strains isolated from Hemicentrotus pulcherrimus in the South China Sea

2.1.2 復(fù)篩

對(duì) 59株抗菌活性陽(yáng)性菌株進(jìn)行復(fù)篩, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)有 10株菌株的發(fā)酵產(chǎn)物抗菌活性較強(qiáng)、抗菌譜較廣(表 2)。其中JSM 076062抗菌活性最強(qiáng), 對(duì) 6株指示菌有抗菌活性; JSM 076009、JSM 076050和JSM 076100抗菌活性相對(duì)較弱; 其余6株分別對(duì)5株指示菌有抗菌活性。這 10株抗菌活性較好的菌株都能夠同時(shí)抑制革蘭氏陰性和陽(yáng)性菌株; 除了JSM 076077和JSM 076100外, 8株對(duì)真菌也有抑制作用。

表2 海膽分離菌株抗菌活性復(fù)篩結(jié)果Tab. 2 Results of the second-round antimicrobial activity screening of strains isolated from Hemicentrotus pulcherrimus in South China Sea

2.2 抗菌活性陽(yáng)性菌株的生物學(xué)特征

對(duì)10株抗菌效果較好的菌株進(jìn)行了培養(yǎng)特征、細(xì)胞形態(tài)和生理生化特征等生物學(xué)特性的觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 10株菌的 NaCl耐受范圍廣(0～25%), 其中JSM 076102為耐鹽菌, JSM 076050和JSM 076077為輕度嗜鹽菌, 其他 7株為中度嗜鹽菌[20]。10個(gè)菌株都為中溫菌, 最適生長(zhǎng)溫度在25～32°C之間。其他生物學(xué)特征特征見(jiàn)表3。

2.3 基于 16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)10個(gè)抗菌活性較強(qiáng)、抗菌譜較廣的菌株進(jìn)行基因組DNA提取、16S rRNA基因PCR擴(kuò)增測(cè)序后,所得序列提交GeneBank注冊(cè), 序列號(hào)見(jiàn)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1)?；?6S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明, 這 10個(gè)菌株屬于兩個(gè)門(mén)(Firmicutes, Proteobacteria)中的4個(gè)科(Bacillaceae, Enterobacteriaceae,Planococcaceae, Staphylococcaceae)的7個(gè)屬, 除了1株(JSM 076077)屬于Proteobacteria門(mén)外, 其他9株均屬于Firmicutes門(mén)。

從10株菌株的生物學(xué)特性來(lái)看, 這些菌株的生物學(xué)特性與各自的典型菌株差異不明顯, 綜合分析生物學(xué)特性和系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果, 可以初步認(rèn)為,這 10株具有較強(qiáng)抗菌活性的菌株分別屬于Halobacillus屬(JSM 076029、JSM 076017、JSM 076062),Bacillus屬(JSM 076053、JSM 076009),Pontibacillus屬(JSM 076056),Planococcus屬(JSM 076050),Jeotgalibacillus屬(JSM 076100),Salinicoccus屬(JSM 076102)和Serratia屬(JSM 076077), 其中JSM 076056是本實(shí)驗(yàn)室有效發(fā)表新種Pontibacillus halophilus的典型菌株[21]。

3 討論

根據(jù)已有的報(bào)道, 海洋抗菌活性物質(zhì)產(chǎn)生菌株主要集中在交替單胞菌屬(Alteromonassp.), 節(jié)桿菌屬(Arthobacter), 芽孢桿菌屬(Bacillus), 黃桿菌屬(Flavobacterium), 微球菌屬(Micrococcus), 莫拉菌屬(Moraxella), 假單胞菌屬(Pseudomonas), 海洋假互生單胞菌屬(Pseudoalteromonas), 小紅卵菌屬(Rhodovulum), 玫瑰桿菌屬(Roseobacter), 紅細(xì)菌屬(Ruegeria), 希瓦氏菌屬(She-wanella), 葡萄球菌屬(Staphylococcus), 弧菌屬(Vibrio)等屬的菌株[22-23]。本研究結(jié)果表明, 南海海膽相關(guān)可培養(yǎng)細(xì)菌中有較高比例的菌株能產(chǎn)生抗菌生物活性物質(zhì), 抗菌陽(yáng)性率高達(dá)55.7%, 與Bernan等[6]的研究結(jié)果一致。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明這些菌株具有豐富的生物多樣性,分屬于 2個(gè)門(mén) 4個(gè)科的 7個(gè)屬(Bacillus,Jeotgalibacillus,Halobacillus Pontibacillus,Planococcus,Salinicoccus,Serratia)。除了Bacillus外, 有關(guān)其余6個(gè)屬菌株抗菌活性篩選的研究鮮見(jiàn)報(bào)道[22-23]。本研究及本實(shí)驗(yàn)室近年來(lái)的相關(guān)研究結(jié)果表明, 南海硇洲島海域的部分無(wú)脊椎動(dòng)物相關(guān)微生物具有豐富的多樣性[11-12], 并蘊(yùn)藏了較多的新類(lèi)群(物種)[21,24-27],海膽等無(wú)脊椎動(dòng)物的相關(guān)微生物中有很多菌株能產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)。

表3 10株抗菌活性菌株的生物學(xué)特性Tab. 3 Phenotypic characteristics of the ten antimicrobial-activity-positive strains

海洋無(wú)脊椎動(dòng)物產(chǎn)生的大量結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物, 因其具有獨(dú)特的生物活性已被應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)研究[28], 但是直接從海洋無(wú)脊椎動(dòng)物來(lái)提取這些化合物存在供應(yīng)量低, 價(jià)格昂貴的問(wèn)題。海洋中的微生物分布非常廣泛, 它們有的自由生活在海水中, 有的存在于一些海底沉淀物或海泥的表面, 還有一部分與海洋動(dòng)植物處于共生、共棲、寄生或附生的關(guān)系。從海洋微生物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多結(jié)構(gòu)新穎的化合物, 其中許多化合物具有較高的抗腫瘤活性, 海洋微生物作為抗腫瘤活性物質(zhì)的新來(lái)源正日益為國(guó)內(nèi)外海洋研究工作者所重視。近10年來(lái)的研究表明海洋微生物提取物中至少有 10%具有細(xì)胞毒活性, 美國(guó)每年有1 500個(gè)海洋化合物單體被分離出來(lái), 其中 1%具抗腫瘤作用[29-31], 日本科學(xué)者研究發(fā)現(xiàn), 27%的海洋微生物具有抗菌活性[32]。如鹽藻等可產(chǎn)生胡蘿卜素, 不僅具有藥用功能, 而且還是一種脂溶性的、良好的食用色素, 可以應(yīng)用于食品加工工業(yè)[33]; Beja等[34]用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在海洋細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌視紫紅質(zhì)。從海洋微生物中發(fā)現(xiàn)的生物活性物質(zhì)包括胺及酰胺類(lèi)、乙酰配基類(lèi)、吲哚生物堿類(lèi)、環(huán)肽類(lèi)及聚丙酸酯類(lèi)等, 其生物活性包括抗菌、抗微生物、抗腫瘤、抗病毒、抗輻射、酶及酶的抑制劑等等。越來(lái)越多的研究也表明, 海洋微生物, 尤其是那些跟海洋動(dòng)物或海洋植物存在共生或寄生等關(guān)系的微生物, 能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)獨(dú)特并具強(qiáng)烈生理活性的代謝產(chǎn)物[35], 姜健等[36]和張連茹等[37]分別從海膽及海膽卵中分離得到抗菌, 抗腫瘤, 抗氧化和產(chǎn)唾液酸的微生物?？傊? 從海洋微生物中分離出的這些活性物質(zhì)在醫(yī)藥、化妝品、保健食品、著色劑、食品添加劑, 科學(xué)研究和工業(yè)發(fā)展等方面具有廣闊的應(yīng)用前景, 為推動(dòng)整個(gè)人類(lèi)社會(huì)的發(fā)展提供了豐富的資源[38-41]。

圖1 根據(jù)16S rRNA基因序列構(gòu)建的10株具有抗菌活性菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 1 Neighbor-Joining tree constructed based on 16S rRNA gene sequence analysis showing the phylogenetic relationships among ten antimicrobial-activity-positive strains and their closely related taxa. Numbers at nodes indicate bootstrap values (＞50%) based on a neighbor-joining analysis of 1000 resampled datasets. Bar, 2 substitutions per 100 nucleotides

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Screening and biological characteristics of antibiotic- producing bacteria from sea urchins

HUANG Ke, LIU Zhu-xiang, CHEN Qi-hui, HE Jian-wu, SU Yin, ZHANG Li, CHEN Yi-guang
(Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Utilization of Hunan Province, College of Biology and Environment Science, Jishou University, Jishou 416000, China)

Oct., 12, 2010

Associated bacteria with sea urchin; antimicrobial activity; biological characteristics; phylogenetic analysis

The antimicrobial activity of 106 marine bacteria, isolated from sea urchins (Hemicentrotus pulcherrimus) collected from the coastal area of the Naozhou island in the South China Sea, were screened using the cylinder-plate method on 8 indicator microorganisms, i.e. three Gram-positive bacteria (Bacillus subtilis,Sarcina lutea,Staphylococcus aureus), three Gram-negative bacteria (Aerobacter aerogenes,Escherichia coli,Proteus vulgaris), and two fungi (Asperillus niger,Candida albican). Out of 106 test strains, 59 were positive in antimicrobial activity (55.7%), in which 10 strains exhibited strong antimicrobial activity. These 10 strains were submitted for 16S rRNA gene amplification and phylogenetic analysis after morphological, biochemical,and physiological characterization. It was found that the 10 strains were within the phyla Firmicutes and Proteobacteria, belong to the generaHalobacillus(JSM 076029, JSM 076017, JSM 076062),Bacillus(JSM 076053, JSM 076009),Pontibacillus(JSM 076056),Planococcus(JSM 076050),Jeotgalibacillus(JSM 076100),Salinicoccus(JSM 076102), andSerratia(JSM 076077).

Q939

A

1000-3096(2011)08-0025-07

2010-10-12;

2011-01-23

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30970007)

黃 苛(1983-), 男(瑤族), 湖南溆浦人, 碩士, 研究方向?yàn)槲⑸镔Y源與生態(tài), E-mail： hkll520@163.com; 陳義光, 通信作者,電話： 0743-8564416, E-mail： mchenjsu@yahoo.com.cn

梁德海)