李莉,顧欣,崔潔,孟阿會(huì),侯亞坤,王建中

隨著現(xiàn)代食品工業(yè)的發(fā)展,人們逐漸認(rèn)識(shí)到天然色素具有諸多優(yōu)點(diǎn),開(kāi)發(fā)并研究新的天然色素成為研究熱點(diǎn)。板栗殼棕色素是從廢棄的板栗殼中提取出來(lái)的一種天然棕色素,此棕色素含量高,穩(wěn)定性較強(qiáng),耐熱,經(jīng)高溫處理后,顏色無(wú)明顯變化且抑菌效果不發(fā)生明顯的改變,可用于高溫操作中;耐光,在日光,燈光及紫外光等照射下無(wú)明顯顏色變化;耐酸堿,在pH=4～14內(nèi)色調(diào)穩(wěn)定[1],不僅可以用于食品著色,還可用于紡織品著色等工業(yè)領(lǐng)域[2]。多數(shù)研究表明,板栗殼棕色素的主要活性成分為黃酮類(lèi)化合物,而黃酮類(lèi)化合物一般都具有抗氧化活性,因此板栗殼棕色素相關(guān)性質(zhì)的研究具有十分重要的意義。本文用磷鉬試劑、清除 DPPH自由基、清除羥基自由基和清除超氧陰離子 4種評(píng)價(jià)方式,分析比較了質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的 NaOH溶液和體積分?jǐn)?shù) 40%的乙醇溶液提取的板栗殼棕色素的抗氧化性能,并比較堿提栗殼棕色素和醇提栗殼棕色素的紅外光譜圖,以期對(duì)板栗殼棕色素的進(jìn)一步利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

成熟的遷西板栗,250℃烘烤 10 min后剝殼,板栗殼磨粉備用。

1,1-二 苯 基 -2-苦 肼 基 (1,1-dipheny1-2-picrylhydrazyl,DPPH),Sigma公司 ;VC,2,6-二叔丁基 -4-甲基苯酚(BHT)、鄰苯三酚、鉬酸銨、三羥甲基氨基甲烷 (Tris)、磷酸鈉、溴化鉀、硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸、氫氧化鈉,天津市津科精細(xì)化工研究所;分析純?cè)噭?98%濃硫酸、無(wú)水乙醇、鹽酸,北京化工廠(chǎng);分析純?cè)噭┰囼?yàn)用水為蒸餾水。

1.2 試驗(yàn)儀器

752 SPECTROPHOTOMETER紫外分光光度計(jì),上海美譜達(dá)儀器有限公司;冷凍離心機(jī),美國(guó) Ther mo Fisher Scientific公司;冷凍干燥機(jī) (LL1500),美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;Nesus670紅外光譜儀,美國(guó) Nicolet公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 堿提板粟殼色素

用 1%的 NaOH溶液浸泡粉碎的板栗殼,在 50℃的水浴中提取 5h,然后抽濾取清液,用 0.1 mol/L HCl調(diào)成中性,分別用石油醚和乙酸乙酯各洗滌 3次,以除去脂溶性成分,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至 1/10體積后冷凍干燥,得堿提板栗殼棕色素Ⅰ,稱(chēng)重,計(jì)算堿提栗殼棕色素提取得率,色素備用[1]。

1.3.2 醇提板粟殼色素

用 40%的乙醇溶液浸泡粉碎的板栗殼,在 50℃水浴中提取 5 h,然后抽濾取清液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至 1/10體積后冷凍干燥,得醇提板栗殼棕色素Ⅱ,稱(chēng)重,計(jì)算醇提栗殼棕色素提取得率,色素備用。

式中:m色素,冷凍干燥后得到色素的質(zhì)量;m栗殼,用于提取色素的栗殼的質(zhì)量。

用蒸餾水分別溶解堿提栗殼棕色素、醇提栗殼棕色素和VC并配制成以下所需的各個(gè)濃度,備用;用無(wú)水乙醇溶解 BHT并配制成以下所需的各個(gè)濃度,備用。

1.3.3 磷鉬絡(luò)合物法測(cè)定板栗殼棕色素總抗氧化活性

磷鉬絡(luò)合物法測(cè)定總抗氧化活性的原理是Mo(V I)被抗氧化物質(zhì)還原能夠生成綠色的Mo(V)絡(luò)合物,在波長(zhǎng) 695 nm處有最大吸收波長(zhǎng),而且抗氧化物質(zhì)活性越強(qiáng),測(cè)定的吸光度值越大[3-4]。

磷鉬試劑的配制:0.6 mmol/L硫酸,28 mmol/L磷酸鈉和 4 mmol/L鉬酸銨。

在 15 mL具塞試管中分別加入 4 mL磷鉬試劑,再加入 0.4 mL濃度分別為 0.1,0.5,1.0,1.5,2.0 mg/mL的堿提栗殼棕色素、醇提栗殼棕色素、BHT和VC,95℃反應(yīng) 90 min,自然晾涼至室溫,695 nm測(cè)吸光度值A(chǔ),對(duì)應(yīng)物質(zhì)的抗氧化性越強(qiáng),則測(cè)定的吸光度值A(chǔ)越大,用ΔA來(lái)反映物質(zhì)的總抗氧化活性。

式中:Ax,加樣品后的吸光度值;Ax0,空白吸光度值

1.3.4 清除DPPH自由基的方法測(cè)定板栗殼棕色素抗氧化活性

1,1-二苯基苦基苯肼 (DPPH)是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基,溶于乙醇呈紫色,在可見(jiàn)光區(qū)的 517 nm處存在最大吸收峰,且其濃度與吸光度呈線(xiàn)性關(guān)系,通過(guò)被測(cè)物質(zhì)對(duì)DPPH自由基的清除能力可以表示其抗氧化性的強(qiáng)弱。

稱(chēng)取 0.003 8 g DPPH用無(wú)水乙醇溶解,定容至50 mL,搖勻得到濃度為 2×10-4mol/L的 DPPH溶液,放在冰箱中備用。在 15 mL具塞試管中分別加入2 mL濃度分別為 0.02、0.06、0.10、0.14、0.18、0.20 mg/mL的醇提栗殼棕色素、堿提栗殼棕色素、BHT和VC。再分別加入 2mL DPPH溶液,避光反應(yīng) 30 min后在 517 nm處測(cè)定吸光度。以 2 mL樣品溶液加入2 mL無(wú)水乙醇作為對(duì)照,以 2 mL DPPH溶液加入 2 mL蒸餾水作為空白,計(jì)算對(duì) DPPH自由基的清除率[5-9]。

Ai:2 mLDPPH溶液 +2 mL樣品溶液;Ai0:2 mL樣品溶液 +2 mL無(wú)水乙醇;A0:2 mLDPPH+2 mL蒸餾水。以無(wú)水乙醇溶液作為參比。

1.3.5 清除羥基自由基 (·OH)的方法測(cè)定板栗殼棕色素抗氧化活性

Fenton反應(yīng)是以 H2O2為氧化劑,以 Fe2+為催化體系的氧化反應(yīng),在反應(yīng)中生成羥基自由基 (·OH),分析·OH對(duì)水楊酸-乙醇體系的氧化情況,確定待測(cè)樣品的存在是否對(duì)·OH有清除作用。與此同時(shí),Fe2+被氧化成 Fe3+可能產(chǎn)生混凝沉淀。

稱(chēng)取 0.083 4 g FeSO4·7H2O溶于少量蒸餾水中,然后轉(zhuǎn)移到 50 mL容量瓶中準(zhǔn)確定容,得到 6 mmol/L FeSO4溶液;稱(chēng)取 0.041 4 g水楊酸溶于少量無(wú)水乙醇中,然后轉(zhuǎn)移到 50 mL容量瓶中用無(wú)水乙醇準(zhǔn)確定容,得到 6 mmol/L的水楊酸-乙醇體系;用微量移液器量取 166.7μL 30%的雙氧水用蒸餾水定容至 50 mL容量瓶中,得到 0.1%的 HO[10-11]。22

在 15 mL的具塞試管中分別加入 1 mL 6 mmol/LFeSO4溶液,1 mL 6 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液,再分別加入 1 mL濃度分別為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL樣品溶液,最后加入 1 mLH2O2啟動(dòng)反應(yīng),37℃水浴反應(yīng) 30 min后,以 8 000 r/min速度離心 5 min,取上清液在 510nm處測(cè)定吸光度,以蒸餾水代替 H2O2作為對(duì)照組,以蒸餾水代替樣品作為空白。

Ai:為樣品組;Ai0:以蒸餾水代替 H2O2的對(duì)照組;A0:以蒸餾水代替樣品的空白。

采用鄰苯三酚自氧化的方法,稱(chēng)取三羥甲基氨基甲烷 (Tris)12.11g,用蒸餾水溶解定容至 1 000 mL,得到 0.1 mol/L Tris溶液;取 50 mL 0.1 mol/L Tris溶液與 22.9 mL 0.1 mol/L鹽酸混勻并稀釋至 100 mL,調(diào)整 pH值為 8.2,得到 50 mmol/LTris-HCl緩沖溶液;稱(chēng)取 0.037 8 g鄰苯三酚用 10 mmol/L HCl解定容至 100 mL,得到 3 mmol/L鄰苯三酚,棕色瓶,避光保存。

取 50 mmol/L Tris-Hcl緩沖溶液 (pH=8.2)2.25 mL,加入 2 mL濃度分別為 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL的待測(cè)樣品 (對(duì)照加蒸餾水),混勻后 25℃水浴保溫 20 min,然后加入 3 mmol/L的鄰苯三酚 0.3 mL,反應(yīng) 2 min后,在 325 nm處測(cè)吸光度,每 30 s測(cè)定一次,共測(cè)定 5 min(10個(gè)數(shù)據(jù))。以反應(yīng)時(shí)間為橫坐標(biāo),對(duì)應(yīng)吸光度A值為縱坐標(biāo),計(jì)算斜率,以斜率反映鄰苯三酚的自氧化速率,以蒸餾水作為對(duì)照,計(jì)算樣品對(duì)·的清除率[12-13]。

V樣品:加入樣品后鄰苯三酚自氧化速率;V對(duì)照:加入蒸餾水后鄰苯三酚自氧化速率。

1.3.8 板栗殼棕色素的紅外光譜分析

稱(chēng)取堿提板栗殼棕色素和醇提板栗殼棕色素各2 g,稱(chēng)取 2 000 g的溴化鉀粉末 2份,將板栗殼棕色素分別與溴化鉀粉末在瑪瑙研缽中研成細(xì)粉并混勻,灌注于模具中進(jìn)行壓片,置于紅外光譜儀中進(jìn)行測(cè)定。掃描范圍為 4 000～400 cm-1;分辨率 8 cm-1,掃描次數(shù) 32次。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿提醇提板栗殼色素的得率

采用 1%的 NaOH溶液提取板栗殼棕色素的得率為 25.3%,用 40%的乙醇溶液提取板栗殼棕色素的得率為 27.1%,提取得率很接近。

2.2 板栗殼棕色素抗氧化效果檢驗(yàn)

2.2.1 總抗氧化性測(cè)定結(jié)果

從圖1中可以看出,堿提栗殼棕色素、醇提栗殼棕色素、BHT和VC的抗氧化能力都隨樣品濃度的增加而增強(qiáng),VC的總抗氧化能力最強(qiáng),其次是醇提栗殼棕色素,濃度在 0～1.60 mg/mL時(shí),BHT的總抗氧化能力略強(qiáng)于堿提栗殼棕色素,濃度高于 1.60 mg/mL以后,堿提栗殼棕色素的總抗氧化能力強(qiáng)于BHT。

圖1 不同樣品的總抗氧化能力比較

2.2.2 對(duì) DPPH自由基的清除效果

從圖2中可以看出,堿提栗殼棕色素、醇提栗殼棕色素、BHT和 VC對(duì) DPPH自由基都具有清除作用,VC的清除作用最強(qiáng),然后依次是醇提栗殼棕色素、堿提栗殼棕色素和 BHT,隨著樣品濃度的升高,對(duì)DPPH的清除作用都逐漸增強(qiáng)。VC在較低濃度0.02 mg/mL時(shí),對(duì) DPPH的清除率就可以達(dá)到87.9%;醇提栗殼棕色素在濃度為 0.20 mg/mL時(shí),清除率可以達(dá)到 85%左右,此時(shí)與 VC的效果比較接近。醇提栗殼棕色素的 IC50值約為 0.02 mg/mL,堿提栗殼棕色素的 I C50值約為 0.09 mg/mL。

圖2 不同濃度樣品清除DPPH自由基能力比較

2.2.3 對(duì)羥基自由基 (·OH)的清除效果

從圖3中可以看到,堿提栗殼棕色素、醇提栗殼棕色素、BHT和 VC都對(duì)·OH具有清除作用,且都隨著樣品濃度增大清除作用增強(qiáng),在低濃度 0.50～1.00 mg/mL時(shí),BHT＞醇提栗殼棕色素 ＞堿提栗殼棕色素 ＞VC,在 1.20～2.00 mg/mL內(nèi),堿提栗殼棕色素 ＞VC＞醇提栗殼棕色素 ＞BHT;較大濃度 2.10～2.50 mg/mL內(nèi),VC＞堿提栗殼棕色素 ＞醇提栗殼棕色素 ＞BHT。VC的 IC50值約為 1.57 mg/mL,堿提栗殼棕色素的 IC50值約為 1.62 mg/mL,對(duì)·OH的清除效果相當(dāng)于 VC的 96.91%,醇提栗殼棕色素的I C50值約為 1.90 mg/mL,對(duì)·OH的清除效果相當(dāng)于VC的 82.63%,均比 BHT清除效果強(qiáng)。

圖3 不同濃度樣品清除羥基自由基的能力

從圖4中可以看出,堿提栗殼棕色素、醇提栗殼棕色素、BHT和 VC對(duì)都具有清除作用,但 VC和BHT對(duì)清除效果明顯強(qiáng)于 2種栗殼棕色素,堿提栗殼棕色素和醇提栗殼棕色素隨著濃度增大對(duì)清除效果逐漸增強(qiáng),濃度高于 0.95 mg/mL時(shí),堿提栗殼棕色素清除的效果強(qiáng)于等濃度的BHT。堿提栗殼棕色素的 IC50值約為 0.71 mg/mL,醇提栗殼棕色素的 IC50值約為 0.83 mg/mL,濃度低于 0.42 mg/mL時(shí),醇提栗殼棕色素清除的效果強(qiáng)于堿提栗殼棕色素;濃度高于 0.42 mg/mL時(shí),堿提栗殼棕色素清除效果強(qiáng)于醇提色素。

圖4 不同濃度樣品清除超氧陰離子的能力

2.3 堿提栗殼棕色素和醇提栗殼棕色素的紅外光譜分析[14-15]

圖5 醇提栗殼棕色素 (a)和堿提栗殼棕色素 (b)的紅外光譜圖

堿提栗殼棕色素的紅外光譜和醇提栗殼棕色素的紅外光譜均在 3 300～3 500 cm-1內(nèi)出現(xiàn)較強(qiáng)的吸收峰,此為 O—H鍵的伸縮振動(dòng)峰;在 2 924 cm-1出現(xiàn)吸收峰,此處是甲基與亞甲基的 C—H伸縮振動(dòng)峰,在 1 600 cm-1附近出現(xiàn)吸收峰,堿提栗殼棕色素在 1 607.24 cm-1處,醇提栗殼棕色素在 1 613.48 cm-1處為芳香環(huán)的伸縮振動(dòng)。

在 1 500～500 cm-1內(nèi) 2種栗殼棕色素的吸收峰有所差異,譜圖顯示 (圖5)醇提栗殼棕色素的吸收峰略多于堿提栗殼棕色素。

堿提栗殼棕色素在 1 427.50、1 102.13、621.70 cm-1有強(qiáng)弱不等的吸收峰。醇提栗殼棕色素在1 525.50、1 445.98、1 355.07、1 045.80、596.65 cm-1處有強(qiáng)弱不等的吸收峰。

3 結(jié)論

研究表明,1%的 NaOH溶液和 40%的乙醇溶液提取的板栗殼棕色素都具有一定的抗氧化性,但是評(píng)價(jià)方法不同相應(yīng)反映出的抗氧化能力也不同。堿提栗殼棕色素,醇提栗殼棕色素和 BHT的總抗氧化能力比較接近,但弱于 VC;磷鉬試劑法反映出總抗氧化能力都隨著樣品濃度的增大而增強(qiáng);清除 DPPH自由基時(shí),VC清除效果最強(qiáng),然后依次是醇提栗殼棕色素,堿提栗殼棕色素和 BHT,VC在較低濃度 0.02 mg/mL時(shí),對(duì) DPPH的清除率就可以達(dá)到 87.9%,醇提栗殼棕色素在濃度為 0.20 mg/mL時(shí),清除率可以達(dá)到 85%左右,醇提栗殼棕色素的 IC50值約為 0.02 mg/mL,堿提栗殼棕色素的 IC50值約為 0.09 mg/mL;清除羥基自由基 (·OH)時(shí),隨著色素濃度增大對(duì)·OH的清除作用增強(qiáng),堿提栗殼棕色素,醇提栗殼棕色素,BHT和 VC的抗氧化效果接近,VC的 IC50值約為 1.57 mg/mL,堿提栗殼棕色素的 IC50值約為 1.62 mg/mL,對(duì)·OH的清除效果相當(dāng)于 VC的 96.91%,醇提栗殼棕色素的 IC50值約為 1.90 mg/mL,對(duì)·OH的清除效果相當(dāng)于 VC的 82.63%,均比 BHT清除效果強(qiáng)很多;清除超氧陰離子 (·)時(shí),堿提栗殼棕色素的 IC50值約為 0.71 mg/mL,醇提棕色素的 IC50值約為 0.83 mg/mL,2種溶液提取的栗殼棕色素清除效果比較接近,但弱于 BHT和 VC。醇提栗殼棕色素和堿提栗殼棕色素的紅外光譜圖在吸收峰上存在一定的差異性。

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