江春紫，陳 平，賈 放，王如鋒

(武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023)

正交試驗(yàn)法優(yōu)選肝毒清膠囊的提取工藝

江春紫，陳 平，賈 放，王如鋒

(武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023)

探討肝毒清膠囊處方中有效成分芍藥苷、甘草酸、甘草苷的最佳提取工藝條件。采用正交試驗(yàn)，考察粉碎粒度，浸泡時(shí)間，加水量，煎煮時(shí)間，煎煮次數(shù)等因素對肝毒清膠囊處方中芍藥苷、甘草酸、甘草苷提取率的影響，實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法測定有效成分的含量。優(yōu)化后的提取工藝為：甘草粒徑為0.9—2mm，白芍為0.9—2mm，加16倍量的水，浸泡1 h，煎煮3次，每次2h。在此提取條件下，提取量達(dá)16.893 mg/g，優(yōu)選出的工藝可適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

肝毒清膠囊;正交實(shí)驗(yàn);提取工藝

健肝樂顆粒是目前已在臨床應(yīng)用多年且已上市銷售的名優(yōu)中成藥，肝毒清膠囊是在健肝樂顆?；A(chǔ)上進(jìn)行二次開發(fā)研究的產(chǎn)品。健肝樂的原方來源于我國漢代醫(yī)圣張仲景的《傷寒論》中的“芍藥甘草湯”，主要功效為斂陰養(yǎng)血、柔肝舒筋、緩急止痛，在臨床廣泛應(yīng)用于治療各種內(nèi)科疾患，距今已有2000多年的使用歷史［1］。健肝樂顆粒就是在“芍藥甘草湯”的基礎(chǔ)上研制而成的治療肝炎的中成藥，其主要成分為從國內(nèi)外公認(rèn)的治療肝炎的良藥——白芍、甘草中提取到的有效部位。白芍為毛莨科植物芍藥的干燥根，在處方中起君藥作用，其主要有效成分為芍藥總苷，而芍藥苷是芍藥總苷中的主要成分［2-4］;甘草系豆科甘草屬植物，其有效成分有甘草酸，甘草苷［5］。因此，本文擬以芍藥苷，甘草酸，甘草苷三者的總提取量的綜合得量作為考察指標(biāo)，對肝毒清軟膠囊最佳提取工藝進(jìn)行探索，為其開發(fā)提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

白芍(武漢金匙藥業(yè)有限公司，Radix Paeoniae Alba);甘草(湖北省中藥材有限公司飲片廠，Radix Glycyrrhizae);芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品;甘草酸、甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所)。甲醇(色譜純，科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心)，乙腈(色譜純，科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心)，冰醋酸(分析純，科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心)，醋酸銨(分析純，科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心)，磷酸(分析純，科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心)。高效液相色譜儀(鼎泰科技發(fā)展有限公司);高效液相色譜柱(Welchrom-C18;5μm，4.6 ×250 mm);高速萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司);電爐(武漢嘉華爐業(yè)有限公司);循環(huán)式多用真空泵(北京醫(yī)療設(shè)備廠);恒溫水浴鍋(北京醫(yī)療設(shè)備廠)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以提取物中芍藥苷、甘草酸、甘草苷三者的含量為指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)考察了白芍粒度(A)，甘草粒度(B)，浸泡時(shí)間(C)，加水量(D)，煎煮時(shí)間(E)，煎煮次數(shù)(F)六個(gè)因素對提取結(jié)果的影響，每個(gè)因素按3個(gè)水平設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案(見表1)。

表1 因素水平表

2.2 供試品溶液的制備

按照正交表L27(313)稱取白芍∶甘草=1.5∶1總共5g，加水、浸泡、煎煮、濾過，濾液定容于150mL容量瓶中，取出25mL定容于100mL容量瓶中，用0.45μm的微孔濾膜過濾，取25μL注入液相色譜儀測定。

2.3 芍藥苷、甘草酸和甘草苷的含量測定方法［6］

①色譜柱為Welchrom C18(5μm，4.6 ×250 mm)，柱溫30℃，流量1.0mL/min，芍藥苷流動相為乙腈—0.1%磷酸(16∶84)，檢測波長為230nm;甘草酸流動相為甲醇—0.2mol/L醋酸銨溶液—冰醋酸(67∶33∶1)，檢測波長為250nm;甘草苷流動相為乙腈—0.5%冰醋酸(20∶80)，檢測波長為276nm。

②測定方法：精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品和供試品溶液25 μL，注入液相色譜儀，測定即可。

③芍藥苷、甘草酸、甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的高效液相(HPLC)圖譜見圖1。

2.3.1 芍藥苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品3.4 mg，加甲醇溶解于25 mL的容量瓶中，用微量移液器取出20 μL、40μL、 80 μL 、 120 μL 、 160 μL，配成濃度為0.0136mg/mL、0.0272mg/mL 、0.0544mg/mL 、0.0816mg/mL、0.1088mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣，記錄積分面積。以峰面積對芍藥苷濃度進(jìn)行擬合，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=457.84x －1.3959，r=0.9992。

2.3.2 甘草酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品5.3 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，既得(0.212mg/mL)。精密吸取甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.5 mL、1mL、2mL、4mL、8mL置10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成濃度為10.6 μg/mL、21.2μg/mL、 42.4 μg/mL 、 84.8 μg/mL 、 169.6 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，搖勻，取25μL依次注入液相色譜儀測定。以甘草酸濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，得回歸方程為 A=0.21x－0.0711，r=0.9998。

2.3.3 甘草苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品5.3 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，既得(0.212mg/mL)。精密吸取上述甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液50μL ，100 μL，200 μL，400 μL，800 μL，加甲醇稀釋至 1mL，制成濃度為 10.6 μg/mL，21.2 μg/mL，42.4 μg/mL，84.8μg/mL，169.6μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，搖勻，取25 μL依次注入液相色譜儀測定。以甘草苷濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，得回歸方程為 A=518.15x －0.4417，r=0.9993。

圖1 樣品的高效液相色譜圖

2.4 實(shí)驗(yàn)方法考察

2.4.1 精密度實(shí)驗(yàn)

取同一濃度的芍藥苷、同一濃度甘草酸、同一濃度甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算峰面積。結(jié)果表明，芍藥苷、甘草酸、甘草苷的峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.16%，2.34%，1.76%，均小于5%，表明該儀器的精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批白芍、甘草藥材，按照供試品溶液的制備方法制成供試溶液，進(jìn)樣25μL，由峰面積與濃度的線性關(guān)系換算得濃度，測得芍藥苷、甘草酸、甘草苷的峰面積的 RSD 分別為2.96%，4.62%，1.38%，均小于5%，表明該實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液在室溫下保存，分別于0 h，4 h，8 h，16h，24h測定含量，以標(biāo)準(zhǔn)品與供試品溶液的峰面積之比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。供試品在24 h之內(nèi)穩(wěn)定，芍藥苷、甘草酸、甘草苷峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為 1.54%，0.93%，1.05%，表明芍藥苷、甘草酸和甘草苷在24h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.4.4 回收率試驗(yàn)

稱取6份已知含量的白芍甘草藥材，每份5 g，分別精密加入10mL芍藥苷甘草酸甘草苷對照品溶液(含芍藥苷 1.36 mg，含甘草酸 2.12 mg，含甘草苷2.12mg)，照2.2中供試品溶液的制備方法分別制備樣品，進(jìn)樣測定，測得總量減去各組分含量，即得回收率，算得芍藥苷、甘草酸、甘草苷的回收率分別為 98.1%，103.54%，100.05%，表明三者的回收率良好。

3 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)白芍甘草兩味藥材在處方中的比例，確定芍藥苷、甘草酸、甘草苷的權(quán)重系數(shù)分別為0.6，0.2，0.2，其綜合得量即為：綜合得量 =(芍藥苷含量×0.6)+(甘草酸含量×0.2)+(甘草苷含量×0.2)。正交試驗(yàn)結(jié)果及分析見表2、表3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

對上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析和方差分析，結(jié)果表明，煎煮次數(shù)、甘草粒度、煎煮時(shí)間和加水量對白芍甘草的綜合提取率有非常顯著的影響，而白芍粒徑與浸泡時(shí)間兩個(gè)因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有顯著性影響，各因素對綜合提取率影響的大小順序?yàn)榧逯蟠螖?shù)＞甘草粒徑＞煎煮時(shí)間＞加水量＞白芍粒徑＞浸泡時(shí)間。由試驗(yàn)結(jié)果分析可知最佳提取工藝為F3B2E3D2A3C1，即甘草粒徑為0.9—2mm，白芍粒徑為0.9—2mm，加16倍量的水，浸泡 1 h，煎煮三次，每次2h。在此提取條件下，綜合提取率最高，可達(dá)16.893mg/g。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2、表3。

表3 方差分析表

4 結(jié)論

從上面的正交實(shí)驗(yàn)表可看出，煎煮次數(shù)和甘草粒徑對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響很顯著。中藥的煎煮是中藥中的有效成分不斷釋放，溶解的過程，當(dāng)中藥中與藥液中的有效成分濃度平衡后，這個(gè)過程就停止了［7］。故我們通常增加煎煮次數(shù)以獲取更多的有效成分，通常以2—3次為宜。從上面正交實(shí)驗(yàn)表格中數(shù)據(jù)可知，白芍甘草混合煎煮時(shí)煎3次最佳。從正交表2可看出，甘草酸粒徑對芍藥苷的含量也有顯著的影響，有文獻(xiàn)報(bào)道，甘草中的甘草酸有增溶作用［8］;另也有文獻(xiàn)報(bào)道，甘草與白芍混合煎煮時(shí)，甘草能促進(jìn)白芍中有效成分含量的提取［9］。故甘草酸的粒徑對芍藥苷含量的顯著影響是有科學(xué)依據(jù)的。

由高效液相圖譜可見，芍藥苷、甘草酸、甘草苷的分離度較好，且出峰時(shí)間適中。

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，提取次數(shù)對提取率影響最大，甘草粒徑次之，浸泡時(shí)間影響最小。為考慮生產(chǎn)成本，本實(shí)驗(yàn)最終確定的提取工藝為：甘草粒徑0.9—2mm，白芍粒徑為 0.9—2 mm，加 16 倍量的水，浸泡1h，煎煮3次，每次2 h。在此提取條件下，綜合提取率可達(dá)16.893mg/g。

［1］ 陳平，陳新.健肝樂軟膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2007，27(11)：1528-1530.

［2］ 陳四平，張浩.中藥白芍的研究進(jìn)展［J］.承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào).2008.25(3)：293-295.

［3］ 張雪榮，張靜.RP-HPLC法測定健肝樂顆粒中芍藥苷的含量［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(21)：9834-9835.

［4］ 谷滿倉，錢亞芳.白芍的化學(xué)成分及質(zhì)量控制方法研究進(jìn)展［J］.科技通報(bào)，2006，22(3)：337-341.

［5］ 陳紅.甘草藥理作用概述［J］.海峽藥學(xué)，2005，17(4)：37-41.

［6］ 中華人民共和國藥典委員會.中國藥典2005版(一部)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：76.

［7］ 廖仰平.煎煮工藝對湯劑質(zhì)量的影響［J］.中國民族民間醫(yī)藥.2008，9(3)：9-10.

［8］ 杜薇.甘草的溶解性研究［J］.湖南中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，1996，2(6).32-33.

［9］ 何麗仙，黃宗京.HPLC研究芍藥甘草湯合煎與分煎的化學(xué)成分變化［J］.云南師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，29(6)：32-35.

Optimization of extraction process of“GanDuQing”capsule by orthogonal design

JIANG Chun-zi，CHEN Ping，JIA Fang，WANG Ru-feng
(School of Biology and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China)

To study the optimization extraction process conditions of paeoniflorin and liquorice in“GanDuQing”capsule，we study the experimental conditions such as time and ratio of material－ fluid influencing the extracting efficiency of White paeoniae alba and liquorice.The result is as follows，when the liquorice particlesize is 0.9-2mm，white Paeony Root is 0.9-2mm，ratio of material－ fluid is 1∶16 and soaking time is 1h，extraction 3 times and each time is 2h，the total extraction rate of“GanDuQing”capsule is 16.893mg/g.The optimum extraction technology is scientific and reasonable，and it is suitable for industrial production.

“Gan Du Qing”capsule;orthogonal test;extraction technology

TQ 461

A

1009-4881(2011)02-0024-05

10.3969/j.issn.1009-4881.2011.02.007

2010-11-22.

江春紫(1984-)，女，碩士研究生，E-mail：iznuhzgnaij@163.com.

陳平(1958-)，女，教授，E-mail：chenpingvip24@163.com.