田國政,孫東發(fā),汪興平

(1.湖北民族學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

根霉在釀酒工業(yè)中用來作淀粉質(zhì)原料釀酒的糖化菌，我國是最早利用根霉糖化淀粉生產(chǎn)酒精、分解大豆蛋白制醬的國家，在激素、酶制劑等方面的應(yīng)用也在不斷深入[1].ERh1123、ERh3421、ERh5131 3個根霉菌株是從恩施酒曲中分離出來的優(yōu)勢根霉菌株[3]，在適宜的溫度、pH值、水分、營養(yǎng)等條件下便開始繁殖生長[2]，在繁殖生長的過程中能產(chǎn)生大量的糖化酶、液化酶、蛋白酶等，根霉生長的好壞、產(chǎn)酶量及酶的活性均受到生長環(huán)境的限制，本文主要從pH條件方面研究根霉的生長及其對產(chǎn)酶活性的影響.

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料：ERh1123 、ERh3421、ERh5131 3個根霉菌株保存在湖北民族學(xué)院微生物實驗室， 3～5℃冰箱保藏.

儀器設(shè)備：UV-2550型分光光度計，日本島津公司；CR-21G型離心機(jī)，日本Hitachi公司；萬分之一電子天平，上海天平儀器廠；高壓蒸汽鍋，上海；超凈工作臺，上海物理光學(xué)儀器廠；新飛冰箱，河南新飛電器有限公司；恒溫震蕩器，金壇市富華儀器有限公司；酸度計，美國Thermo720A+.

試劑：Na2SeO3、NaCO3、 Na2HPO4、H2O2、HNO3NaOH、Ni(NO30)2、酪氨酸、酒石酸鉀鈉、結(jié)晶酚、亞硫酸鈉、三氯乙酸、檸檬酸、酪素、磷鉬酸、磷鎢酸、硫酸鋰、溴水、葡萄糖、淀粉、3,5-二硝基水楊酸(試劑均為AR).

1.2 方法

1.2.1 PDA培養(yǎng)基 馬鈴薯200 g，水1 000 mL，煮沸30 min，紗布過濾，再加20 g蔗糖和20 g瓊脂，熔化后補足蒸餾水至1 000 mL.

1.2.2 不同pH值的培養(yǎng)基 按參考文獻(xiàn)[4]進(jìn)行，pH值范圍是3.4、4.0、4.6、5.2、5.8、6.4、7.0,121℃滅菌40 min后迅速搖散.

1.2.3 孢子懸液的制備 將其接種于PDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)3 d，加入20 mL無菌水,制備接種用的孢子懸液.

1.2.4 不同pH值培養(yǎng)基發(fā)酵的處理 取孢子懸液0.5 mL接種于不同pH值培養(yǎng)基中，搖勻，30℃培養(yǎng)4 d得鮮曲，測定糖化酶、液化酶、蛋白酶活性，重復(fù)3次.

1.2.5 酶活力測定

1.2.5.1 液化酶、糖化酶活力測定與葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 按參考文獻(xiàn)[5，6]的方法進(jìn)行.得回歸方程A=0.717 75C+0.010 24，r=0.997 0.

1.2.5.2 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作與蛋白酶活力測定 按參考文獻(xiàn)[7]的方法進(jìn)行，得回歸方程A=0.001 920 5C-0.005 185 9， r=0.999 6.

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值培養(yǎng)基對3個根霉菌株產(chǎn)糖化酶活性的影響

根霉在生長的過程中受環(huán)境條件pH值的影響較大，主要表現(xiàn)為根霉的產(chǎn)酶能力和產(chǎn)酶活力方面.如圖1所示，隨著pH值的升高，糖化酶活力漸漸升高，在pH3.4時，菌株ERh1123產(chǎn)糖化酶的活力最低，pH 4.6時，糖化酶活力最大，為1.41×102U/g，在pH 5.2～7.0之間變化很小.而ERh3421、ERh5131菌株產(chǎn)糖化酶適宜的pH值為5.2.

2.2 pH值培養(yǎng)基對3個根霉菌株產(chǎn)液化酶活性的影響

由圖2可知，ERh1123菌株產(chǎn)液化酶的能力隨著pH值升高而上升，pH 4.6時，液化酶活性達(dá)到最高，為2.2×103U/g，之后酶的活性開始慢慢下降.ERh3421產(chǎn)液化酶的活性沒有明顯的變化，ERh5131產(chǎn)液化酶的活性隨pH值上升而緩慢上升.

圖1 不同pH值對3個菌株糖化酶的影響 圖2 不同pH值對3個菌株液化酶的影響Fig.1 The effects of different pH on the saccharification enzyme activities Fig.2 The effects of different pH on the liquefied enzyme activities

2.3 pH值培養(yǎng)基對3個根霉菌株產(chǎn)蛋白酶活性的影響

由圖3可知，在一定pH值范圍內(nèi)，對根霉產(chǎn)蛋白酶活性的影響較小.ERh3421、ERh5131菌株產(chǎn)蛋白酶的活性在pH值3.4～5.2時緩緩下降， pH 5.8時產(chǎn)蛋白酶的活性又上升到2.38×102U/g，以后又開始下降.ERh1123菌株在pH 3.4～7.0產(chǎn)蛋白酶的活性影響幾乎沒有變化.

2.4 反應(yīng)pH值條件對糖化酶活性的影響

在適宜的pH條件下培養(yǎng)根霉菌株得到的酶液在不同的pH值條件下與底物反應(yīng)，一定時間后測定糖化酶活性.由圖4可知，不同的pH值處理對酶活力的影響較大，pH3.4～4.6時，ERh5131菌株產(chǎn)糖化酶活性呈上升階段，pH 5.2時開始逐漸變小.pH3.4～4.0時，ERh1123、ERh3421產(chǎn)糖化酶活力沒有變化， pH 4.6時兩菌株產(chǎn)糖化酶的活性分別為3.2×102U/g、2.95×102U/g，pH 5.2以后隨著pH的升高，酶活性下降，下降的幅度較大.與圖1的結(jié)果比較，適宜的pH條件處理能明顯的提高酶的活性.

圖3 不同pH值對3個菌株蛋白酶的影響 圖4 反應(yīng)液pH值對3個菌株糖化酶的影響Fig.3 The effects of different pH on the protease activities Fig.4 The effects of the different reaction pH on the saccharification enzyme activities

2.5 反應(yīng)pH值條件對液化酶活性的影響

從圖5可知，反應(yīng)pH值條件影響著液化酶活性，ERh1123菌株產(chǎn)液化酶液在pH 3.4～5.8之間液化酶液化淀粉的活性逐漸上升，pH 5.8時活性達(dá)到最大，為1.53×103U/g，pH 6.4時劇烈下降幾乎為零，表明該酶的活性對pH值條件非常敏感.ERh5131菌株所產(chǎn)酶液在pH 3.4～5.2之間，液化酶活性隨pH值的升高而上升，pH 5.2時，液化酶活性達(dá)到最大，為1.72×103U/g，pH 6.4時迅速下降.在pH 3.4～5.2時，ERh3421菌株產(chǎn)液化酶活性逐漸上升，pH 5.2達(dá)到最大，為1.24×103U/g，pH值5.8開始下降.

2.6 反應(yīng)pH值條件對蛋白酶活性的影響

從圖6可知，在一定pH值范圍內(nèi)，對蛋白酶的活性有一定的影響.pH 3.4～5.2時，蛋白酶活性變化較小， pH 5.8時蛋白酶的活性變大，其中ERh3421菌株產(chǎn)蛋白酶的活性相對較大，其次是ERh1123，ERh5131，蛋白酶的活性依次為2.97×102U/g，2.84×102U/g、2.56×102U/g，pH 6.4以后又開始下降.

圖5 不同反應(yīng)液pH值對3個菌株液化酶的影響 圖6 不同反應(yīng)液pH值對3個菌株蛋白酶活性的影響Fig.5 The effects of different reaction pH on the liquefied enzyme activities Fig.6 The effects of different pH on the protease activities

3 結(jié)論

采用pH值培養(yǎng)基和反應(yīng)pH值條件對3個根霉菌株產(chǎn)酶活性的研究中發(fā)現(xiàn)，pH值對3個根霉菌株的生長及產(chǎn)酶活性的影響較大，在pH 4.6～5.8時，3個根霉菌株產(chǎn)酶活性相對較大，除此之外，酶的活性小很多.實驗的過程中主要對糖化酶、液化酶、蛋白酶的活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)酶的種類不同，適宜的pH范圍不同，根霉菌株產(chǎn)糖化酶液化酶適宜pH為4.6～5.2，糖化酶的活性達(dá)到1.41×102～1.59×102U/g，液化酶的活性達(dá)到0.69×103～2.21×103U/g，菌株產(chǎn)蛋白酶的適宜pH 5.8，蛋白酶活性為1.98×102U/g～2.58×102U/g.酶在反應(yīng)的過程中提供適宜的pH，有利酶促反應(yīng)的進(jìn)行，pH4.6時，糖化酶的活性可提高到1.52×102～3.21×102U/g，蛋白酶在反應(yīng)的過程中提供pH5.8，酶的活性可提高到2.56×102～2.97×102U/g，液化酶在反應(yīng)的過程中受pH值的影響較大，提供pH5.2～5.8，酶的活性明顯高于其他的pH值范圍，與產(chǎn)酶條件下提供的pH相比，不能提高液化酶的活性，但控制pH值是保證穩(wěn)定酶活性的重要手段.在3個菌株中，ERh3421的優(yōu)勢更明顯，其糖化酶、液化酶、蛋白酶的活性高于其他2個菌株.

[1] 周恒剛.試論根霉菌在制曲上的特征[J].釀酒，2001(6)：23-26，39.

[2] 李金生.糖化曲優(yōu)良根霉分離技術(shù)[J].中國調(diào)味品，2002(4)：6-8.

[3] 周光來，田國政.酒曲根霉的純化篩選初報[J].湖北民族學(xué)院學(xué)報:自然科學(xué)版,2000，18(4)：19-20.

[4] 薛應(yīng)龍.植物生理實驗[M].北京：高等教育出版社，1985：157.

[5] 張龍翔，張庭芳，李令媛.生化實驗方法和技術(shù)[M].北京：高等教育出版社，2003，1-3.

[6] 李憲臻，張宇，金鳳燮.兩株曲霉糖化性質(zhì)的比較研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，1994(6)：42-46.

[7] 中山大學(xué)生物系生化微生物教研室.生化技術(shù)導(dǎo)論[M].北京：人民教育出版社，1978：53-54.