楊 卓 張 艷 黎村艷 于 文 曹 斌 余敏君

(南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所,衡陽421001)

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是慢性胃炎、消化性潰瘍和胃癌等上消化道疾病的相關(guān)病原體,空泡細(xì)胞毒素(Vacuolating cytotoxin,VacA)是其主要致病因子之一,因能使多種體外培養(yǎng)的真核細(xì)胞形成空泡而得名。VacA是一種AB型毒素,位于N端的A亞單位(p33,1-311氨基酸殘基)是毒素活性亞單位,位于C端的B亞單位(p55,312-821氨基酸殘基)是與宿主細(xì)胞結(jié)合的部位。Y e等[1]的研究表明,用表達(dá)N端478個(gè)或更多的氨基酸殘基的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞時(shí)VacA出現(xiàn)空泡活性,且VacA引起空泡樣變性的最小片段為422個(gè)氨基酸殘基。

為了進(jìn)一步明確VacA單一毒力決定簇對(duì)GES-1細(xì)胞凋亡的影響,本研究將課題組先前構(gòu)建的VacA N端真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入GES-1細(xì)胞,觀察其對(duì)GES-1細(xì)胞凋亡的影響,以了解 H.pylori入侵宿主后對(duì)宿主的損傷作用,并為在分子水平上闡明其致病性及其可能的致病機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要材料 E.coli JM109、pDsRed-Monomer-C1及其VacA N端真核表達(dá)載體均為本室保存,GES-1胃黏膜上皮細(xì)胞系購(gòu)自中南大學(xué)湘雅中心實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫,倒置顯微鏡系日本Nikon公司產(chǎn)品,透射電鏡為日產(chǎn)/H7500型,DNA聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶、T4連接酶購(gòu)自Promega公司,質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000購(gòu)自Invitrogen公司,兔抗 H.pylori多克隆抗體購(gòu)自Chemicon公司,FITC標(biāo)記羊抗兔IgG購(gòu)自碧云天公司,Hoechst 33342、Rho123染料系Sigma公司產(chǎn)品 ,Annexin-V-FITC-PI試劑盒、Caspass-3、Caspase-9 活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物公司,人細(xì)胞色素C ELISA試劑盒購(gòu)自廣州欣博盛生物公司。

1.2方法

1.2.1重組質(zhì)粒在GES-1細(xì)胞中的表達(dá)與鑒定 人胃黏膜上皮細(xì)胞(GES-1)培養(yǎng)于10%胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培養(yǎng)基,置于37℃、含5%CO2、飽和濕度的溫箱中培養(yǎng)用于實(shí)驗(yàn)。分為空質(zhì)粒組、重組質(zhì)粒組,同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照。參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書以每孔4.0μg質(zhì)粒和10μl的LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染每孔細(xì)胞。37℃、5%CO2孵箱中孵育5小時(shí)后,吸去培養(yǎng)基,換新鮮的含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基2 ml,繼續(xù)培養(yǎng),每6小時(shí)觀察細(xì)胞內(nèi)紅色熒光,于熒光較多時(shí)收集細(xì)胞,加入160 μl細(xì)胞裂解液4℃放置60分鐘,10 000 r/min 4℃離心5分鐘,收獲細(xì)胞裂解上清液經(jīng)SDS-PAGE后,以兔抗H.pylori多克隆抗體為一抗作Western blot鑒定。

1.2.2VacA空泡活性鑒定

1.2.2.1中性紅攝取實(shí)驗(yàn) 按上述方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,37℃、5%CO2孵箱中孵育5小時(shí)后,吸去培養(yǎng)基,換新鮮的含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基1 ml,并加入 100μl 5 mmol/L NH4Cl。分別于轉(zhuǎn)染后 0、6、12、24小時(shí),棄去培養(yǎng)基,100μl 0.05%中性紅染液染色,100μl 1%乙酸乙醇洗脫液洗脫后離心取上清在96孔板比色,在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)洗脫液吸光度。

1.2.2.2電子顯微鏡下觀察 按上述方法分組并轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,37℃、5%CO2孵箱中孵育5小時(shí)后,吸去培養(yǎng)基,換新鮮的含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基1 ml,并加入5 mmo/L NH4Cl。轉(zhuǎn)染后24小時(shí),棄去培養(yǎng)基,用2.5%戊二醛固定細(xì)胞24小時(shí),按電鏡觀察要求處理細(xì)胞,觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3重組質(zhì)粒高表達(dá)對(duì)GES-1細(xì)胞凋亡的影響

1.2.3.1Hoechst 33342染色方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 按上述方法分組并接種GES-1細(xì)胞數(shù)1.0×105于6孔板,設(shè)PBS組為陰性對(duì)照,轉(zhuǎn)染細(xì)胞24小時(shí)后按如下方法操作：細(xì)胞培養(yǎng)基中加入Hoechst33342染液,使終濃度為5μg/ml;之后將6孔板放入37℃避光孵育染色10分鐘,熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.3.2Annexin V-FITC-PI染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡按上述方法分組并轉(zhuǎn)染細(xì)胞,同時(shí)設(shè)置PBS組作為陰性對(duì)照,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。于轉(zhuǎn)染后24小時(shí)收集 GES-1細(xì)胞于1.5 ml EP管中,按Annexin V-FITCPI凋亡檢測(cè)試劑盒說明書處理細(xì)胞,取1×106重懸的細(xì)胞,2 000 r/min離心5分鐘,棄上清,加入500μl Binding Buffer懸浮細(xì)胞,加入5μl Annexin V-FITC混勻后,加入5μl Propidium Iodide,混勻后室溫避光孵育15分鐘,立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.4線粒體跨膜勢(shì)能的檢測(cè) 當(dāng)細(xì)胞呈單層生長(zhǎng)鋪滿培養(yǎng)瓶80%左右時(shí)按實(shí)驗(yàn)要求轉(zhuǎn)染細(xì)胞,24小時(shí)后進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)設(shè)立PBS陰性對(duì)照組及100 μg/L的TNF-α陽性對(duì)照組：胰酶消化并收集細(xì)胞,加入預(yù)冷的PBS漂洗沉淀,加入Rho123染液,使其終濃度為10μg/ml,輕微震蕩使細(xì)胞懸浮,37℃避光孵育30分鐘,離心去除上清液,用PBS洗滌沉淀兩次,加入500μl PBS重懸細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度(Mean fluorescence intensity,MFI)。

圖1 Western blot鑒定 VacA蛋白在 GES-1細(xì)胞中的表達(dá)Fig.1 Western blot analysis of VacA protein from transfected GES-1 cell

1.2.5重組質(zhì)粒高表達(dá)對(duì)GES-1細(xì)胞活化Caspase-9、Caspase-3的影響 按上述方法分組并轉(zhuǎn)染細(xì)胞,同時(shí)設(shè)置PBS組作為陰性對(duì)照,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)置0、6、12、24、48五個(gè)時(shí)相點(diǎn)。離心收集各組經(jīng)不同時(shí)間處理的細(xì)胞(約5×105個(gè)),用PBS洗滌,加入50μl冰Lysis buffer,冰上裂解 20分鐘,4℃10 000 r/min離心1分鐘,上清轉(zhuǎn)移至新EP管中置冰上,用BCA試劑盒測(cè)蛋白濃度,取含有同等量蛋白的上清,分別加入50μl 2×reaction buffer和5μl caspase substrate,37℃避光反應(yīng)4小時(shí),酶標(biāo)儀測(cè)波長(zhǎng)405 nm處的吸光值,以Lysis buffer和2×reaction buffer作參比,計(jì)算與對(duì)照組吸光度的比值,確定活化程度。

1.2.6重組質(zhì)粒高表達(dá)對(duì)GES-1細(xì)胞釋放細(xì)胞色素C的影響 按上述方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞,分為 GES-1細(xì)胞空白對(duì)照組、空質(zhì)粒組、重組質(zhì)粒組,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分別于轉(zhuǎn)染后6、12、24、48小時(shí)時(shí),按照欣博盛公司ELISA試劑盒的說明操作,測(cè)定樣本450 nm處OD值,求出Cyt-C的含量(ng/L)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以±s表示,用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較行單因素方差分析,P＜0.05表示差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1重組質(zhì)粒在GES-1細(xì)胞中的表達(dá) 提取轉(zhuǎn)染48小時(shí)細(xì)胞總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE,以兔抗 H.pylori多克隆抗體為一抗,Western blot分析鑒定表達(dá)產(chǎn)物免疫反應(yīng)性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組出現(xiàn)一條免疫反應(yīng)帶,而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和 GES-1細(xì)胞組未見免疫反應(yīng)帶(圖1)。

2.2VacA空泡活性鑒定

2.2.1VacA高表達(dá)對(duì)GES-1細(xì)胞攝取中性紅的影響 中性紅攝取實(shí)驗(yàn)顯示,轉(zhuǎn)染后6小時(shí),重組質(zhì)粒組的吸光度升高,與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);轉(zhuǎn)染24小時(shí)后,重組質(zhì)粒組的吸光度達(dá)到最高(0.36±0.07);6、12、24小時(shí)三個(gè)時(shí)相點(diǎn)空質(zhì)粒組的吸光度也有所升高,但與對(duì)照組相比,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),見圖2。

2.2.2電鏡觀察結(jié)果 轉(zhuǎn)染后24小時(shí),電子顯微鏡觀察重組質(zhì)粒組可見部分細(xì)胞內(nèi)有大小不等的空泡。大多數(shù)發(fā)生空泡化的細(xì)胞其細(xì)胞核無明顯異常改變,空泡多集中于胞漿及線粒體,另有部分空泡化細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)溶解、細(xì)胞器破碎、細(xì)胞膜破裂等病理改變;同時(shí)細(xì)胞發(fā)生凋亡改變,其表面微絨毛部分脫落、核固縮、碎裂、染色質(zhì)濃集和邊緣化,呈典型的細(xì)胞凋亡特征(圖3)。

2.3 重組質(zhì)粒高表達(dá)對(duì)GES-1細(xì)胞凋亡的影響

2.3.1Hoechst 33342染色檢測(cè)結(jié)果 按照前述試驗(yàn)方法轉(zhuǎn)染處理細(xì)胞24小時(shí)后,如圖4A所示可見,陰性對(duì)照組胞膜完整,胞質(zhì)豐富,核形態(tài)飽滿,表現(xiàn)為彌散均勻的藍(lán)色熒光;空質(zhì)粒組(B)有極個(gè)別細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡現(xiàn)象：而重組質(zhì)粒(C)處理組可見核體積縮小,熒光染色增強(qiáng),染色質(zhì)呈致密濃染的塊狀或顆粒狀熒光形成。

2.3.2Annexin V-FITC-PI雙染檢測(cè)結(jié)果 流式細(xì)胞儀分析各組凋亡情況(表1,圖5),結(jié)果顯示重組質(zhì)粒組細(xì)胞凋亡率較高(43.71%±6.87%),與陰性對(duì)照組(17.59%±5.84%)和空質(zhì)粒組(22.66%±5.61%)相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);空質(zhì)粒組凋亡率與陰性對(duì)照組相比也有輕微升高,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);說明重組質(zhì)粒pDsRed-Monomer-C1/VacA誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞凋亡增加。

圖2 中性紅攝取實(shí)驗(yàn)Fig.2 Neutral Red Uptake

圖3 電子顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)(×10 000)Fig.3 Cell morphology observed by electron microscopy(×10 000)

表1 Annexin V-FITC-PI染色法檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率Tab.1 Apoptosis rate of the GES-1 cell induced by VacA with Annexin V-FITC-PI staining method

圖4 Hoechst 33342染色觀察細(xì)胞凋亡情況(×200)Fig.4 The apoptosis of GES-1 cell line stained by Hoechst 33342(×200)

圖5 Annexin V-FITC-PI染色流式細(xì)胞儀檢測(cè) VacA誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞凋亡Fig.5 Detection of apoptosis of the GES-1 cell induced by VacA with Annexin V-FITC-PI staining method by FCM

2.4重組質(zhì)粒高表達(dá)對(duì)GES-1細(xì)胞線粒體跨膜勢(shì)能的影響 檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽性對(duì)照組(TNF-α誘導(dǎo)組)的膜電位勢(shì)能最低(156.0±8.7),而重組質(zhì)粒VacA組(168.0±8.1)略微高于 TNF-α組(P＞0.05),低于空質(zhì)粒組(215.2±9.3)以及 PBS組(224.1±11.6)。重組質(zhì)粒組與PBS組、空質(zhì)粒組相比皆具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6,P＜0.05)。

圖6 VacA對(duì) GES-1細(xì)胞線粒體跨膜勢(shì)能的影響Fig.6 Effect of mitochondrial transmembrane potential induced by VacA

圖7 VacA對(duì) GES-1細(xì)胞Caspase-9活化的影響Fig.7 The effect of VacA on the activation of Caspase-9 in GES-1 cells

2.5重組質(zhì)粒高表達(dá)對(duì)GES-1細(xì)胞Caspase-9、Caspase-3活化程度的影響 檢測(cè)結(jié)果顯示重組質(zhì)粒組Caspase-9的活化程度呈一定的時(shí)間依賴性,并在處理后12小時(shí)的時(shí)候達(dá)到最高點(diǎn)(3.09±0.09),隨后逐漸降低;而空載體組Caspase-9活化程度并不明顯(圖7,P＞0.05);重組質(zhì)粒組Caspase-3的活化程度亦呈一定的時(shí)間依賴性,且在處理后24小時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)(2.86±0.20),空載體組Caspase-3活化程度亦不明顯(圖8,P＞0.05)。

表2 VacA誘導(dǎo) GES-1細(xì)胞釋放Cyt-C(ng/ml)Tab.2 The concentration of Cyt-C released from GES-1 cells induced by VacA at different time points(ng/ml)

圖8 VacA對(duì) GES-1細(xì)胞Caspase-3活化的影響Fig.8 The effect of VacA on the activation of Caspase-3 in GES-1 cells

圖9 VacA對(duì) GES-1細(xì)胞釋放Cyt-C的影響Fig.9 The effect of V acA on the release of Cyt-C in GES-1 cells Note：＊.P＜0.05 vs pDsRed-Monomer-C1,PBS control.

2.6重組質(zhì)粒高表達(dá)對(duì)GES-1細(xì)胞釋放Cyt-C的影響 按照Human Cytochrome-C ELISA測(cè)定試劑盒的說明書對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行Cyt-C釋放的測(cè)定,發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒組釋放的Cyt-C的濃度呈時(shí)間依賴性正相關(guān)(表2),即隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞釋放的Cyt-C濃度逐漸增高,同空質(zhì)粒組及陰性對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),空質(zhì)粒組的Cyt-C的釋放也有所升高,但與陰性對(duì)照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖 9,P＞0.05)。

3 討論

VacA是 H.pylori的主要毒力因子,諸多報(bào)道顯示,VacA蛋白可能與 H.pylori的體內(nèi)長(zhǎng)期定植有關(guān),可以造成胃上皮細(xì)胞直接損傷,最終導(dǎo)致消化性潰瘍和腫瘤的發(fā)生[2]。研究VacA單一毒力決定簇對(duì)靶細(xì)胞的作用機(jī)制,一種方法是構(gòu)建VacA原核表達(dá)載體,用重組蛋白刺激細(xì)胞[3,4];還有一種方法是構(gòu)建真核表達(dá)載體,將其轉(zhuǎn)入細(xì)胞中,研究它對(duì)細(xì)胞的作用。研究發(fā)現(xiàn),向Hela細(xì)胞中單獨(dú)加入VacA p33或p55重組蛋白細(xì)胞不產(chǎn)生空泡變性,而加入p33或p55重組蛋白混合物后可以產(chǎn)生明顯的空泡活性,證明p55 N端的部分氨基酸殘基是p33功能所必需[5]。

盡管目前研究者已經(jīng)對(duì)VacA蛋白的分子結(jié)構(gòu)、基因信息及其致病性了解較多,但對(duì)VacA蛋白的致病機(jī)制的研究還不是很清楚。本實(shí)驗(yàn)中,我們將課題組前期構(gòu)建的VacA N末端真核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染GES-1細(xì)胞后,Western blot證實(shí)它具有很好的免疫反應(yīng)性,電鏡下和中性紅攝取實(shí)驗(yàn)均顯示VacA在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)后能使 GES-1細(xì)胞產(chǎn)生空泡樣變;多數(shù)空泡化的細(xì)胞其細(xì)胞核形態(tài)無明顯異常,結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞表面還保留微絨毛結(jié)構(gòu),少數(shù)細(xì)胞在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)多個(gè)空泡的同時(shí),細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮并發(fā)生邊緣化,微絨毛部分脫落,呈特征性凋亡改變。VacA可使多種體外培養(yǎng)的真核細(xì)胞系發(fā)生空泡樣變,而空泡樣變又是細(xì)胞凋亡早期的一項(xiàng)顯著特征,因此我們可以設(shè)想通過阻斷空泡樣變來抑制VacA所引起的細(xì)胞凋亡[5]。

目前認(rèn)為細(xì)胞凋亡的途徑主要有2條：死亡受體途徑和線粒體途徑。死亡受體途徑是指細(xì)胞膜上的死亡受體Fas、TNFR和TRA ILR等,與相應(yīng)的配體FasL、TNF-α和TRA IL等結(jié)合后,并通過一系列半胱天冬氨酸蛋白酶(Caspase)的級(jí)聯(lián)激活反應(yīng)誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生;線粒體途徑則是指細(xì)胞在諸如DNA損傷、缺氧或細(xì)胞毒性藥物等凋亡刺激信號(hào)作用下,使線粒體膜透性增加,線粒體內(nèi)某些與凋亡相關(guān)的物質(zhì),如凋亡誘導(dǎo)因子(Apoptosis-inducing factor,AIF)、凋亡蛋白酶激活因子-1(Apoptosis protease activating factor-1,Apaf-1)和Cyt-C等被釋放出來,Apaf-1和Cyt-C能激活Caspase-9,進(jìn)一步激活細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者Caspase-3,產(chǎn)生細(xì)胞凋亡效應(yīng);而AIF可以以非Caspase依賴性方式介導(dǎo)染色質(zhì)濃集和DNA片段化,從而促進(jìn)凋亡。目前認(rèn)為,這兩條途徑可能均參與了H.pylori所致的胃上皮細(xì)胞凋亡[6-8]。線粒體能量代謝障礙會(huì)導(dǎo)致膜電位下降,線粒體跨膜電位在維持線粒體膜的完整性和功能方面起著重要作用,線粒體跨膜電位的降低將使細(xì)胞不可逆轉(zhuǎn)的走向凋亡的結(jié)局。

Cyt-C的釋放使呼吸鏈中斷和ATP終止,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生;AIF可轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核誘導(dǎo)染色體凝聚直至降解,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)中我們采用ELISA法定量檢測(cè)GES-1細(xì)胞胞漿中Cyt-C蛋白濃度的變化,結(jié)果證實(shí)隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞釋放的Cyt-C濃度逐漸增高,這與Ayala等的研究結(jié)果相一致[9]。

在線粒體后凋亡的執(zhí)行階段,目前最受關(guān)注的是Caspase活性的調(diào)節(jié),這包括Cyt-C激活Caspase-9,激活后的Caspase-9直接激活Caspase-3,從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞凋亡。由于Caspase活化而降解作用底物產(chǎn)生的終未效應(yīng)事件即是引起形態(tài)上有著特征改變的細(xì)胞凋亡。因此,Caspase有“凋亡步兵”或“凋亡劊子手”之稱。本實(shí)驗(yàn)中,重組質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染后用分光光度計(jì)法檢測(cè)Caspase-9、Caspase-3的活化程度,發(fā)現(xiàn)前者在較早的時(shí)相點(diǎn)(12小時(shí))活化程度到達(dá)最高值,后者在下一個(gè)時(shí)相點(diǎn)(24小時(shí))活化程度隨之到達(dá)最高點(diǎn),與相關(guān)文獻(xiàn)中關(guān)于線粒體途徑的報(bào)道相符合[10]。

自從 H.pylori被分離培養(yǎng)成功以來,其與胃部疾病的關(guān)系已引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注,就目前研究狀況看,在其致病機(jī)制上尚有許多不相一致或者矛盾的結(jié)論有待進(jìn)一步深入探討;不同毒力因子,不同宿主環(huán)境以及不同背景的體外培養(yǎng)細(xì)胞系均可導(dǎo)致不同甚至相反的結(jié)果,因此選用合適的研究模型研究單因素作用顯得尤為重要。本研究證實(shí)H.pyloriVacA N端片段可活化Caspase-9和Caspase-3,且可能主要通過線粒體途徑誘導(dǎo) GES-1細(xì)胞凋亡。這也許是 H.pylori誘導(dǎo)胃相關(guān)疾病發(fā)生的一個(gè)重要機(jī)制,這為進(jìn)一步研究 H.pylori在體內(nèi)的致病機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),為研制與 H.pylori相關(guān)胃上皮細(xì)胞凋亡異常的新藥打下一定基礎(chǔ)。

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