楊蒙生 賈宏博 谷京城 劉振華 穆蘭

耳石是內(nèi)耳前庭橢圓囊和球囊中一種碳酸鈣生物礦物質(zhì)合成物，在空間定向和平衡保持等方面具有重要的作用。然而，外傷、老齡化、耳毒性藥物、內(nèi)耳缺血、微量元素缺乏等諸多因素均可引起耳石在內(nèi)耳的分布、代謝等發(fā)生變化，臨床上常見的老年平衡障礙、良性陣發(fā)性位置性眩暈、外傷后眩暈等也與其密切相關(guān)[1，2]。

盡管耳石和位覺砂有奇特的外形及重要的生理功能，但目前對其形成及再生卻了解甚少。前庭耳石的再生雖然涉及較多的環(huán)節(jié)，但最主要的首先是有機基質(zhì)和相關(guān)無機鹽離子的相互作用問題。有機基質(zhì)雖然含量較少，但卻與耳石的發(fā)生、代謝和某些病變等關(guān)系重大[3]。研究發(fā)現(xiàn)在斑馬魚和青鳉胚胎期耳內(nèi)均有較強的富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白(SPARC)表達[4，5]，其結(jié)構(gòu)上有與鈣離子高親和力結(jié)合的區(qū)域，而鈣離子是耳石再生過程中一個非常重要的無機鹽離子。成熟動物前庭終末器官SPARC的分布如何，其在成熟耳石破壞后再生過程中的作用是否與胚胎耳石發(fā)生相似，具體的變化和作用如何，這些尚不十分清楚。

本研究利用機械力破壞耳石的動物模型[6，7]，觀察SPARC在豚鼠成熟耳石破壞后再生過程中的分布和變化情況，以期為進一步揭示SPARC在成熟耳石破壞后再生中的作用提供一定實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 選用健康白色紅目豚鼠40只，體重300～400 g，雌雄不限，Preyer’s反射靈敏，鼓膜完整，隨機分為對照組(10只，不給予任何刺激)和離心力高過載刺激組(高G組，30只，給予5 min 10 G的離心力刺激)，高G組又分為高G刺激后當天、三天和七天組，每組各10只，分別于刺激后即刻(0.5～1小時)、第3天和第7天，對陽性癥狀者斷頭處死，剝離聽泡并制作冰凍切片。

1.2離心力高過載刺激方法及觀察指標 高G組刺激方式[6，7]：利用臂長為2 m的動物離心機，以400 deg/s的速度勻速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生10 G的力場環(huán)境；動物右耳向旋轉(zhuǎn)軸心，身體長軸沿旋轉(zhuǎn)軌跡的切線方向與地面平行；頭部通過特制的木盒固定，使其在刺激過程中不會發(fā)生各方向的位移和體位改變，離心力上升速度為1 G/s,達到10 G后開始計時，4 min后以同樣的加速度值減速，這樣動物可受到4 min的+10 G離心力刺激。

刺激完后觀察豚鼠前庭軀體反射，包括有無頭位偏斜、頭位震顫、身體側(cè)斜傾倒、側(cè)滾、原地轉(zhuǎn)圈、行走步態(tài)不穩(wěn)等，以及受刺激后活動增強或減弱，神態(tài)變化，反應(yīng)是否靈敏等，記錄其持續(xù)時間。凡是上述觀察指標中出現(xiàn)其中任何一項或一項以上癥狀者記為陽性，為造模成功的標準。

1.3電鏡觀察 取造模成功(耳石損傷)后動物，快速斷頭處死，取出聽泡，2.5%戊二醛磷酸鹽緩沖液蝸內(nèi)沖洗灌注固定，按常規(guī)掃描電鏡標本制備方法準備，日立SEM-800型掃描顯微鏡下觀察，拍照。

1.4免疫組化SP法染色觀察耳石再生不同階段前庭SPARC的表達 取造模成功的動物于各組相應(yīng)時間點進行組織取材固定，嚴格按試劑盒說明書操作。以細胞質(zhì)和(或)細胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色或黃褐色顆粒為SPARC陽性細胞。免疫組化切片經(jīng)顯微鏡觀察和照相機照相后，采用HMIAS21000型高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)測定各組切片染色的平均灰度值。根據(jù)各組切片染色陽性細胞率和陽性細胞顯色強度進行免疫組化評分(ISH)[8]：A為陽性細胞數(shù)分級，分為5級：0～1%=0、 1%～10%=1、10%～50%=2、50%～80%=3、80%～100%=4，B為陽性細胞顯色強度分級，分為4級：0(陰性)、1(弱陽性)、2(陽性)、3(強陽性)，IHS=A×B。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，組間比較采用方差分析，高G組不同時間兩兩比較使用Post-Hoc方法。

2 結(jié)果

2.1前庭行為學(xué)表現(xiàn) 高G組豚鼠刺激后有23只動物出現(xiàn)陽性癥狀即造模成功，陽性率76.67%(23/30)，當天組8只、三天組7只、七天組8只，每組動物各種癥狀持續(xù)時間普遍較短，均在30 min內(nèi)消失。所有癥狀中，以頭位震顫的發(fā)生率最高，其他癥狀出現(xiàn)時幾乎都伴有頭位震顫。每組各取5只用于檢測SPARC在內(nèi)耳的表達觀察，其余用于電鏡觀察。

2.2電鏡下耳石器變化 對照組未見異常，囊斑表面均勻分布不同大小的耳石，耳石呈現(xiàn)為棱柱體結(jié)構(gòu)，兩端為三棱椎體形，表面光滑，長徑在2～28 μm之間；毛細胞纖毛排列整齊，無明顯粘連及倒伏(圖1a)。高G組刺激后1 h(當天組)囊斑表面出現(xiàn)大量球狀物，在高倍鏡下，可見球狀物主要呈現(xiàn)“線團狀”，由大量的纖維纏繞組成球狀結(jié)構(gòu)(圖1b)；刺激后3 d(3天組)除上述原始初期的球狀物外還可以見球狀物逐步發(fā)生礦化，即纏繞的纖維逐步由類似礦物質(zhì)的東西代替和填充(圖1c)；刺激后7 d(7天組)，原始初期的球狀物逐漸減少，礦化的球狀物逐漸增加，此外可見球狀物與耳石共存的現(xiàn)象：在球狀物之間，夾雜新生的小耳石，這些耳石部分呈啞鈴狀，部分在形狀上已與正常成熟耳石無顯著差別(圖1d)。此外，各組均可見到耳石“變性”現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為耳石表面粗糙、出現(xiàn)裂紋以及大量耳石聚集粘合、結(jié)成團塊狀結(jié)構(gòu)。

2.3前庭SPARC的表達情況 結(jié)果顯示，SPARC蛋白在內(nèi)耳均呈現(xiàn)出“多點”表達的特點，即其并非只在耳石的原位——橢圓囊和球囊囊斑的感覺上皮有表達，在感覺上皮臨近和相對位置的非感覺上皮以及壺腹、半規(guī)管和耳蝸等多個部位均有豐富表達，在橢圓囊和球囊囊腔、半規(guī)管內(nèi)等也有染色陽性物質(zhì)出現(xiàn)。對照組前庭囊斑上皮組織細胞中SPARC有微弱表達，顯色不清或陽性細胞呈淺褐色(圖2a)；當天組前庭囊斑的支持細胞、移行細胞、基底細胞中表達量明顯增強，陽性細胞增多，陽性細胞染色強(圖2b)；三天組和七天組的豚鼠前庭囊斑的所有細胞內(nèi)均可見SPARC有較強的表達(圖2c、d)。各組SPARC免疫組化染色的平均灰度值及IHS評分見表2，與對照組相比，當天組、三天組和七天組中SPARC的表達均增加(即平均灰度值減低)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；高G組三組間SPARC的表達逐漸增強，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與對照組相比，其他三組的IHS評分升高(P<0.05),高G組三組間的評分比較均逐漸升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組豚鼠囊斑中SPARC的表達

注：與對照組比較，*P<0.05

圖1 各組豚鼠囊斑耳石(×2000) a～d依次為對照組、高G刺激后當天組、三天組、七天組

圖2 各組豚鼠囊斑SPARC的表達(SP×200) a～d依次為對照組、高G刺激后當天組、三天組、七天組

3 討論

本研究采用離心力高過載破壞豚鼠成熟耳石[6，7]，發(fā)現(xiàn)豚鼠出現(xiàn)各種行為癥狀持續(xù)的時間普遍很短，均在30 min之內(nèi)恢復(fù)正常，此結(jié)果與Ott等對金魚耳石破壞后觀察的結(jié)果相似[9]，根據(jù)他們的觀點，前庭器官結(jié)構(gòu)上的恢復(fù)時間不會這么短，這種代償可能主要是一種功能性的而非結(jié)構(gòu)性的。

前庭耳石器系統(tǒng)由感受線加速度和重力加速度的球囊和橢圓囊組成，囊斑表面有一層耳石膜，由耳石層、膠質(zhì)層和頂下網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成，耳石是耳石膜的主要組成部分，所以如果其所處的力場發(fā)生改變(如超重)，會引起其結(jié)構(gòu)重量等的變化，此已為許多研究所證實[10]。本實驗電鏡觀察結(jié)果顯示，離心力過載作用會造成耳石的原形態(tài)消失和耳石的再生——球狀物的出現(xiàn)，隨后球狀物逐步向成熟期轉(zhuǎn)化。分析本實驗條件下(離心力高過載作用)引起上述變化的可能原因是：耳石的比重大約是內(nèi)淋巴的3倍，其與下方的膠質(zhì)層借結(jié)締組織緊密相連，10 G環(huán)境下，其與膠質(zhì)層的剪切力增加，但其與膠質(zhì)層的結(jié)合力并未改變，因此極易發(fā)生脫離移位，因此認為高G環(huán)境使耳石與膠質(zhì)層的剪切力成倍增加，從而引起耳石移位和代謝障礙是以上各種結(jié)構(gòu)改變的主要原因，此與頭部外傷時機械性外力打擊造成的耳石移位具有某些相似性[11]。此外，不排除其他諸如機械性作用以及高G作用引起的局部血液循環(huán)障礙等因素的作用。

SPARC是一種具有多種功能的小分子酸性糖蛋白，曾被人們稱作骨連接蛋白、基底膜-40、43K蛋白，是一種分泌性鈣結(jié)合糖蛋白，屬于matricellular蛋白家族[12]，在機體內(nèi)分布廣泛，能在多種組織細胞尤其是在那些正在發(fā)育和重建的組織中表達。其多肽C端有一既可以與細胞外鈣離子結(jié)合也可以與膠原結(jié)合的區(qū)域，可能對鈣離子的分泌和聚集起到輔助作用，并且在其內(nèi)部有一類似卵泡抑素的區(qū)域，可能影響其周圍細胞的增殖、分化和粘附[13]。多肽N端有一與鈣離子高親和力結(jié)合的酸性區(qū)域，可能在成骨和礦化方面起到連接膠原和礦物質(zhì)的作用。2007年在前庭耳石器中發(fā)現(xiàn)了SPARC-like 1, countertrypin, and fetuin-A等蛋白，未能確定其作用[14，15]也說明其可能與前庭耳石器之間存在一定的關(guān)系。

目前對SPARC在前庭的研究多集中于胚胎期動物的研究，Rotllant等[16]最近用斑馬魚研究發(fā)現(xiàn)SPARC是咽部軟骨及內(nèi)耳形成后期階段所必須的有機物；Kang等[17]敲除SPARC基因后，動物耳石在大小、形狀、數(shù)量上出現(xiàn)不同程度的改變以及表現(xiàn)為行為和姿態(tài)的障礙。以上均說明SPARC可能在耳石發(fā)生中起很重要的作用，但對其在成熟耳石中如何表達以及在成熟耳石破壞后的表達部位和強度變化如何等研究卻較少。本研究結(jié)果顯示高G組SPARC的表達部位與對照組相比并無顯著變化，但強度上有差異，離心力高過載刺激后各組在耳石再生過程中，支持細胞、毛細胞中SPARC的表達量顯著增加，并且在一周內(nèi)，隨著離心力高過載刺激后時間的延長，SPARC在前庭囊斑中的表達相應(yīng)增強。結(jié)合形態(tài)學(xué)的改變說明耳石從球形向菱形體和柱狀體逐漸轉(zhuǎn)化的過程中，SPARC的表達呈逐漸增加的趨勢。從SPARC蛋白的分布特點以及其表達趨勢來看，推測其對增加球狀物內(nèi)部的Ca2+濃度以及啟動耳石核心的CaCO3結(jié)晶化方面有很重的作用，提示SPARC與球狀物逐步成熟、發(fā)生礦化形成成熟耳石的過程有關(guān)，即耳石的礦化過程需要大量SPARC等有機物的參與來引起CaCO3結(jié)晶化合融合。但SPARC在耳石再生過程中的具體作用目前尚不清楚，有待進一步深入研究。

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