胡玥 綜述 姬長(zhǎng)友 陳繼川 審校

1 第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所 耳鼻咽喉－頭頸外科（重慶 400042）

老年性聾是一類隨年齡增長(zhǎng)而出現(xiàn)的以雙耳進(jìn)行性高頻聽(tīng)力下降為主要表現(xiàn)的慢性退行性疾病。研究表明，大于65歲的老人中，40%以上受老年性聾困擾［1，2］。隨著中國(guó)逐步進(jìn)入老齡化社會(huì)，老年性聾因嚴(yán)重影響老年人的生活質(zhì)量而受到社會(huì)關(guān)注。目前，老年性聾的發(fā)病機(jī)制并不十分清楚，但研究發(fā)現(xiàn)外周聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)和聽(tīng)覺(jué)中樞功能失調(diào)共同參與了老年性聾的發(fā)病，其中聽(tīng)覺(jué)中樞神經(jīng)細(xì)胞凋亡引起聽(tīng)覺(jué)中樞功能障礙是老年性聾患者聽(tīng)力下降、語(yǔ)言理解能力降低的主要原因之一［1，3］。

凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）是一類抑制細(xì)胞凋亡的內(nèi)源性抑制蛋白。Lois Miler實(shí)驗(yàn)室成員最早在桿狀病毒體內(nèi)發(fā)現(xiàn)一組能抑制被感染細(xì)胞發(fā)生凋亡的蛋白，并將其命名為IAP蛋白［4］。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，與IAP蛋白具有同源性的蛋白在哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)、細(xì)菌等許多物種體內(nèi)普遍表達(dá)。迄今為止，研究者們發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)IAP家族共包含8個(gè)成員，其中X染色體連鎖凋亡抑制蛋白 （X－linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）結(jié)構(gòu)最典型、抗細(xì)胞凋亡效應(yīng)最明顯、功能最全面，被認(rèn)為是IAP家族中抑制細(xì)胞凋亡能力最強(qiáng)的成員。

明確XIAP對(duì)老年性聾聽(tīng)皮層相關(guān)細(xì)胞的抗凋亡作用，對(duì)臨床治療老年性聾、提高老年人生活質(zhì)量具有重要意義。本文就腺病毒介導(dǎo)外源性XIAP高表達(dá)抑制聽(tīng)皮層GABA能神經(jīng)元凋亡與老年性聾的相關(guān)性研究進(jìn)展作一綜述。

1 XIAP的分子結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制

XIAP基因位于Xq24－25，能表達(dá)含497個(gè)氨基酸、3個(gè)BIR結(jié)構(gòu)域、1個(gè)RING結(jié)構(gòu)域、相對(duì)分子量約為57kDa的 XIAP蛋白［5］。BIR結(jié)構(gòu)域包含 BIR1、BIR2、BIR3三部分。目前，BIR1區(qū)的結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制尚不清楚，但已明確其能協(xié)同BIR2區(qū)抑制caspase－3和caspase－7［6］。BIR2區(qū)包含3個(gè)反向平行β片層、4個(gè)α螺旋、3個(gè)高保守半胱氨酸和1個(gè)組氨酸，每個(gè)BIR2區(qū)能螯合一個(gè)鋅原子。在BIR1區(qū)的協(xié)同作用下，BIR2區(qū)能與caspase－3和caspase－7結(jié)合并抑制其活性［7］，通過(guò)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞膜三條途徑共同抑制細(xì)胞凋亡。BIR3區(qū)能直接與caspase－9結(jié)合形成異源二聚體，使caspsae－9喪失活性，從而終止caspase途徑、抑制細(xì)胞凋亡［8］。由此可見(jiàn)，BIR結(jié)構(gòu)域是抑制細(xì)胞凋亡的重要結(jié)合位點(diǎn)。RING結(jié)構(gòu)域是位于XIAP C端的鋅指結(jié)構(gòu)域，具有IAP鋅指結(jié)構(gòu)的共性，能通過(guò)自身泛素化實(shí)現(xiàn)自身及結(jié)合蛋白的降解，協(xié)助其他抑制劑共同抑制細(xì)胞凋亡，是XIAP抗凋亡的重要結(jié)構(gòu)。XIAP在人體正常組織中廣泛表達(dá)，除外周血淋巴細(xì)胞外的所有組織均表達(dá)。此外，XIAP在許多病理組織甚至腫瘤組織中也有表達(dá)，且其表達(dá)量與疾病預(yù)后密切相關(guān)。XIAP分布的廣泛性及其抑制細(xì)胞凋亡的特殊性使其成為近幾年來(lái)研究者們研究的熱點(diǎn)。

細(xì)胞凋亡是一種特殊的死亡方式，是在基因調(diào)控下的主動(dòng)死亡過(guò)程，與凋亡過(guò)程中酶的參與密切相關(guān)。Caspase家族是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵元件。目前發(fā)現(xiàn)，Caspase家族至少包含14個(gè)成員，其中caspase－9是線粒體中caspase途徑的起始因子，caspase－3和caspase－7是下游的執(zhí)行者。XIAP中BIR3結(jié)構(gòu)域能直接與csapase－9結(jié)合，使caspase－9保持單體形式，抑制caspase下游級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而抑制相關(guān)活性蛋白的水解并抑制細(xì)胞的凋亡和損傷。Caspase－3是caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵酶，細(xì)胞凋亡途徑的必經(jīng)之路［9］。XIAP中BIR2區(qū)與caspase－3結(jié)合并抑制其激活，與caspase－7結(jié)合、抑制其活性并協(xié)同抑制caspase－3活性，從而完全終止caspase下游的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。因此，XIAP的BIR結(jié)構(gòu)域能通過(guò)抑制caspase途徑的起始位點(diǎn)和共同途徑兩方面抑制細(xì)胞凋亡，是XIAP抑制細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一。

目前研究表明［10］，XIAP不僅通過(guò)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)途徑抑制細(xì)胞凋亡，還可經(jīng)核因子－κB（nuclear factor－kgene binging，NF－κB）途徑抑制細(xì)胞的凋亡。XIAP通過(guò)泛素化連接酶激活NF－κB經(jīng)典途徑，促進(jìn)NF－κB抑制劑的凋亡。同時(shí)，NF－κB能通過(guò)正反饋?zhàn)饔谜{(diào)節(jié)XIAP促進(jìn)其表達(dá)上調(diào)。XIAP中RING結(jié)構(gòu)域具有泛素化連接酶活性，因此，對(duì)其進(jìn)行抑制即能通過(guò)抑制NF－κB途徑以達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡的目的。有研究表明［11］，XIAP還能通過(guò)抑制c－Jun氨基端激酶（c－Jun N－terminal binases，JNK）的激活抑制其促細(xì)胞凋亡作用。

2 XIAP抑制老年性聾聽(tīng)皮層GABA能神經(jīng)元凋亡效應(yīng)

2.1 聽(tīng)皮層GABA神經(jīng)元凋亡是聽(tīng)皮層功能紊亂致老年性聾的重要原因之一

老年性聾在老年人群中普遍存在，配戴助聽(tīng)器雖然解除了部分老年性聾患者的困擾，但其作為聽(tīng)力輔助設(shè)備，不能替代中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)聽(tīng)覺(jué)信號(hào)傳遞、分析和加工的作用。研究發(fā)現(xiàn)［12，13］，老年性動(dòng)物模型聽(tīng)皮層capase－3表達(dá)明顯升高、神經(jīng)凋亡速率增加，證明聽(tīng)覺(jué)通路神經(jīng)元的退行性病變及相關(guān)細(xì)胞的凋亡導(dǎo)致聽(tīng)覺(jué)中樞的機(jī)能減退是老年性聾的主要病理變化之一。

聽(tīng)皮層神經(jīng)元可分為興奮性神經(jīng)元和抑制性神經(jīng)元。肖伯奎等［14］檢測(cè)大鼠聽(tīng)皮層最常見(jiàn)的興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)和抑制性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)含量時(shí)發(fā)現(xiàn)，聽(tīng)皮層興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸（Glu）的含量較高，而抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ－氨基丁酸（GABA）和甘氨酸（Gly）的含量均較低，提示聽(tīng)皮層神經(jīng)元的反應(yīng)以興奮性效應(yīng)為主，抑制性效應(yīng)為輔，當(dāng)聽(tīng)皮層損傷后，因神經(jīng)元的去抑制作用，導(dǎo)致神經(jīng)元的興奮性明顯增加。GABA和Gly為大腦皮層最典型的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，聽(tīng)皮層GABA含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Gly含量。由此推測(cè)，GABA能神經(jīng)元的凋亡可能是老年性聾的重要機(jī)制。Larry［15］研究年輕及老年大鼠聽(tīng)皮層神經(jīng)元差異時(shí)證實(shí)，隨著年齡的改變，聽(tīng)皮層功能及神經(jīng)化學(xué)遞質(zhì)發(fā)生變化，最突出的變化是GABA能神經(jīng)遞質(zhì)明顯減少，進(jìn)一步證明，聽(tīng)皮層GABA能神經(jīng)元的凋亡是導(dǎo)致聽(tīng)覺(jué)中樞功能障礙的重要原因，是老年性聾患者聽(tīng)力及語(yǔ)言理解能力降低的主要機(jī)制之一。

2.2 XIAP在老年性聾聽(tīng)皮層GABA能神經(jīng)元表達(dá)的研究進(jìn)展

在聽(tīng)力學(xué)領(lǐng)域，很多學(xué)者在體外研究中已經(jīng)證實(shí)XIAP能有效抑制藥物、年齡、創(chuàng)傷等因素引起聽(tīng)覺(jué)相關(guān)器官細(xì)胞凋亡。Wang等［16］將攜帶有6－Myc標(biāo)記的人XIAP基因轉(zhuǎn)入2月齡和14月齡C57BL／6J小鼠體內(nèi)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，并以此為實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物進(jìn)行聽(tīng)性腦干反應(yīng)（ABR）測(cè)試、耳蝸毛細(xì)胞圖分析、Western－blot分析和毛細(xì)胞數(shù)據(jù)分析及計(jì)算，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因組小鼠聽(tīng)力損失明顯減輕，尤其是高頻聽(tīng)力和耳蝸內(nèi)源性XIAP表達(dá)量明顯優(yōu)于非轉(zhuǎn)基因組，而聽(tīng)毛細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯減少；實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物耳蝸XIAP高表達(dá)，但大腦皮層聽(tīng)覺(jué)中樞XIAP表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化，證明內(nèi)源性XIAP的高表達(dá)通過(guò)抑制耳蝸毛細(xì)胞的凋亡抑制老年性聾的發(fā)展。

大量研究致力于內(nèi)源性XIAP表達(dá)與局部聽(tīng)覺(jué)器官形態(tài)學(xué)和功能變化的相關(guān)性研究，忽略了外源性XIAP高表達(dá)對(duì)大腦皮層聽(tīng)覺(jué)中樞神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)學(xué)和功能變化的影響。探索外源性XIAP在聽(tīng)皮層高表達(dá)與聽(tīng)力相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在聯(lián)系，可能是研究老年性聾的新途徑，對(duì)全面認(rèn)識(shí)、研究和治療聽(tīng)覺(jué)疾病具有重要的作用。李洪波等［17，18］首次對(duì)大腦皮層聽(tīng)覺(jué)中樞XIAP和caspase－3表達(dá)量與老年性聾的相關(guān)性進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)以15只2月齡（青年組）和15只10月齡（老年組）C57BL／6J小鼠為動(dòng)物模型，采用ABR、末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的原位缺口末端標(biāo)記染色法（TUNEL）及免疫組織化學(xué)法（SP法）檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物反應(yīng)閾、聽(tīng)覺(jué)皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡量及聽(tīng)覺(jué)皮層神經(jīng)細(xì)胞中XIAP、caspase－3表達(dá)量。結(jié)果顯示，老年組小鼠ABR反應(yīng)閾、凋亡的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)及caspase－3表達(dá)量明顯高于2月齡青年組小鼠，但XIAP表達(dá)量結(jié)果剛好相反，且聽(tīng)覺(jué)皮層神經(jīng)細(xì)胞中caspase－3表達(dá)量與XIAP表達(dá)量及ABR反應(yīng)閾負(fù)相關(guān)。實(shí)驗(yàn)揭示了聽(tīng)覺(jué)皮層X(jué)IAP及caspase－3表達(dá)水平與老年性聾密切相關(guān)，XIAP可能通過(guò)caspase－3途徑抑制聽(tīng)皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡從而達(dá)到改善老年性聾患者語(yǔ)言識(shí)別能力的目的。

目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)關(guān)于XIAP抑制聽(tīng)皮層GABA能神經(jīng)元凋亡與老年性聾相關(guān)性的報(bào)道。由此啟示，構(gòu)建能穩(wěn)定表達(dá)外源性XIAP的重組腺病毒載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)染老年性聾聽(tīng)覺(jué)皮層可能抑制聽(tīng)皮層GABA能神經(jīng)元凋亡，從而抑制老年性聾的發(fā)生、發(fā)展，對(duì)增強(qiáng)老年性聾患者的聽(tīng)力及對(duì)語(yǔ)言的理解能力具有現(xiàn)實(shí)意義。明確外源性XIAP抑制聽(tīng)皮層GABA能神經(jīng)元凋亡作用是研究老年性聾的新方向，為臨床尋找老年性聾的治療方法指明了新道路。

3 腺病毒介導(dǎo)XIAP（Ad－XIAP）在聽(tīng)皮層GABA能神經(jīng)元高表達(dá)與老年性聾相關(guān)性的研究展望

第三代腺病毒載體是目前實(shí)驗(yàn)室常用載體系統(tǒng)之一，其宿主廣泛、滴度較高、安全性好，在基因治療相關(guān)疾?。?9］和疫苗載體［20，21］研究領(lǐng)域中備受青睞。隨著腺病毒載體系統(tǒng)在實(shí)驗(yàn)及臨床研究的廣泛應(yīng)用，第三代腺病毒載體系統(tǒng)靶向性不明確、具有免疫原性和細(xì)胞毒性等缺點(diǎn)不容忽視。針對(duì)這些問(wèn)題，研究者們［22，23］通過(guò)改良腺病毒載體系統(tǒng)局部結(jié)構(gòu)、改變腺病毒轉(zhuǎn)染方法及免疫抑制劑暫時(shí)降低宿主免疫力等方法，以提高腺病毒靶向性、降低細(xì)胞毒性。

目前關(guān)于XIAP在老年性聾聽(tīng)皮層表達(dá)的研究剛剛展開(kāi)，雖然國(guó)內(nèi)外尚無(wú)關(guān)于重組腺病毒介導(dǎo)XIAP（Ad－XIAP）在聽(tīng)皮層GABA能神經(jīng)元高表達(dá)與老年性聾相關(guān)性的研究報(bào)道，但構(gòu)建重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染顱腦神經(jīng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)早已廣泛開(kāi)展，技術(shù)已經(jīng)非常成熟。Hermann等［24］對(duì)C57BL／6J小鼠進(jìn)行顱內(nèi)重組腺病毒注射研究基因治療對(duì)大腦中動(dòng)脈損傷的保護(hù)作用；同年該作者［25］再次對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)感覺(jué)皮層立體定向注射重組腺病毒載體，研究神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)感覺(jué)皮層凍傷的治療作用。盡管尚未見(jiàn)到Ad－XIAP轉(zhuǎn)染聽(tīng)皮層的實(shí)驗(yàn)報(bào)道，但重組腺病毒轉(zhuǎn)染顱腦神經(jīng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的廣泛開(kāi)展使Ad－XIAP轉(zhuǎn)染聽(tīng)皮層GABA能神經(jīng)元實(shí)驗(yàn)具備了實(shí)踐的可行性。有研究［26］表明，腺病毒攜帶XIAP轉(zhuǎn)染大鼠海馬部位可通過(guò)抑制caspase－3途徑保護(hù)大鼠CAI海馬神經(jīng)元因短暫性腦缺血引起的死亡；Zadro－Lamoureux等［27］通過(guò)構(gòu)建攜帶XIAP的腺病毒載體轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后，發(fā)現(xiàn)其能保護(hù)視網(wǎng)膜外核層神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用使其免于凋亡。越來(lái)越多的研究者［28～30］開(kāi)展了重組腺病毒轉(zhuǎn)染皮層神經(jīng)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，從側(cè)面證明重組腺病毒載體攜帶外源性XIAP（Ad－XIAP）轉(zhuǎn)染大腦聽(tīng)皮層GABA能神經(jīng)元具有理論可行性。

綜上所述，Ad－XIAP轉(zhuǎn)染聽(tīng)皮層神經(jīng)細(xì)胞介導(dǎo)XIAP在聽(tīng)皮層高表達(dá)，可通過(guò)抑制caspase－3通路有效抑制聽(tīng)皮層GABA能神經(jīng)元凋亡，從而改善老年性聾患者癥狀。因此，外源性XIAP在聽(tīng)覺(jué)皮層的高表達(dá)抑制GABA能神經(jīng)元凋亡可能是研究老年性聾發(fā)病機(jī)制的新思路，是臨床治療老年性聾的新方法，對(duì)老年性聾的預(yù)防和診治具有啟發(fā)和引導(dǎo)作用。推測(cè)Ad－XIAP對(duì)臨床治療老年性聾具有較高的潛在應(yīng)用價(jià)值，必將成為一種新型的治療老年性聾的途徑。

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