溫 晶 ,寇志華 ,于 虹,呂興茹,王 欣,郭 彥,俞建萍,趙光宇 ,周育森

人傷寒沙門菌Ty21a菌蛻的制備＊

溫 晶 ,寇志華 ,于 虹,呂興茹,王 欣,郭 彥,俞建萍,趙光宇 ,周育森

目的 探討利用噬菌體PhiX174 E基因制備人傷寒沙門菌 Ty21a菌蛻的可行性以及適當(dāng)制備條件。方法將PhiX174 E基因克隆至溫控表達(dá)系統(tǒng),篩選獲得裂解效率較高的質(zhì)粒pMBE,通過優(yōu)化轉(zhuǎn)化方法將pMBE導(dǎo)入 Ty21a,利用溫控表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行 Ty21a菌蛻制備。菌落計(jì)數(shù)計(jì)算菌蛻裂解效率,并通過掃描電鏡和透射電鏡觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)。結(jié)果裂解質(zhì)粒pMBE介導(dǎo)大腸桿菌DH5α的裂解效率達(dá)99.99%;通過電擊轉(zhuǎn)化方法獲得重組 Ty21a(pMBE),利用溫控表達(dá)系統(tǒng)成功制備 Ty21a菌蛻,裂解效率達(dá)96.77%。電鏡觀察菌蛻結(jié)構(gòu)完整并呈空泡狀結(jié)構(gòu),并能看到溶菌孔道。結(jié)論P(yáng)hiX174 E基因表達(dá)可實(shí)現(xiàn)人傷寒沙門菌 Ty21a裂解形成Ty21a菌蛻,為其作為疫苗和藥物遞送載體的研究奠定了基礎(chǔ)。

Ty21a菌;細(xì)菌菌蛻;電擊轉(zhuǎn)化;噬菌體 PhiX174 E基因

細(xì)菌菌蛻(Bacterial Ghost)是在革蘭氏陰性菌中誘導(dǎo)表達(dá)來自噬菌體PhiX174的 E基因,導(dǎo)致細(xì)菌裂解而形成的完整細(xì)菌空殼。PhiX174 E基因編碼一個(gè)由91個(gè)氨基酸組成的疏水性蛋白質(zhì),E蛋白間寡聚化促使內(nèi)、外膜在通道處融合,并形成一個(gè)直徑介于200 nm和400 nm的特異性跨膜通道[1-3],胞內(nèi)的物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的作用下由通道排出。由于制備過程較溫和且無需變性作用,因此細(xì)胞壁在很大程度上被完整保存下來。細(xì)菌菌蛻本身可直接作為一種很好的疫苗,因?yàn)槠浔Ａ袅嘶罹鸂顟B(tài)下的包膜結(jié)構(gòu)和相關(guān)抗原蛋白,如脂多糖、Cp G和菌毛等,從而能有效地被抗原遞呈細(xì)胞吞噬、加工和遞呈。實(shí)驗(yàn)已證明,菌蛻通過口服[4]、皮下、靜脈、滴鼻[5]等途徑免疫小鼠、兔子、豬[6]等動(dòng)物,可誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答。另外,可將外源性抗原蛋白、核酸或藥物等導(dǎo)入到菌蛻中,使細(xì)菌菌蛻成為一種新的疫苗和藥物的遞送體系。目前以細(xì)菌菌蛻作為DNA疫苗遞送體系研究的僅限于大腸桿菌和曼海姆菌[7-9]。

減毒沙門菌能以自然感染的方式如胃腸道感染進(jìn)入人體,是腸道免疫的有效細(xì)菌載體。目前減毒沙門菌已被用于多種人獸共患病的核酸疫苗載體[10],具有導(dǎo)入效率高,費(fèi)用低,制備方法簡便等特點(diǎn)。人傷寒沙門 Ty21a疫苗株是由 Germanier等于1975年將野生株Ty2經(jīng)化學(xué)突變劑亞硝基胍處理而獲得的突變株[11],實(shí)驗(yàn)證實(shí),Ty21a疫苗株安全性好,并且以其作為疫苗遞送體系可誘導(dǎo)產(chǎn)生較好的免疫保護(hù)作用,但存在潛在的毒力回復(fù)的可能。目前國內(nèi)外尚沒有 Ty21a菌蛻的相關(guān)研究。本研究首次利用溫控誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)制備人傷寒沙門菌Ty21a菌蛻,成功獲得了具有完整內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的Ty21a菌蛻,有望成為疫苗和藥物的新型遞送系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒 人傷寒沙門菌 Ty21a疫苗株,購自中國藥品生物制品檢定所;大腸桿菌 E.coli DH5α購自全式金公司;噬菌體 PhiX174購自美國典型培養(yǎng)物中心(A TCC13706-B1);質(zhì)粒pBV 220為溫控型表達(dá)載體,由病毒基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室張智清教授惠贈(zèng);裂解質(zhì)粒pBVE和pMBE,由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。裂解質(zhì)粒pBVE是將 PhiX174 E裂解基因克隆到溫控表達(dá)質(zhì)粒pBV 220中獲得的;而裂解質(zhì)粒pMBE是在pBVE的基礎(chǔ)上引入了幽門螺桿菌Rep A復(fù)制調(diào)控元件而獲得的重組裂解質(zhì)粒。

1.1.2 主要試劑 胰蛋白胨、酵母提取物均購自O(shè)xoid公司;質(zhì)粒提取試劑盒購自 TIANGEN公司;各種限制性內(nèi)切酶、PCR試劑盒和其它工具酶均購自大連寶生物有限公司;引物合成及測序服務(wù)由大連寶生物有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 裂解質(zhì)粒pBVE和pMBE對(duì)大腸桿菌裂解效率的比較 取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌 E.coli DH5α(pBVE)和 E.coli DH 5α(pMBE)單克隆分別接種到 LB(100μg/m L氨芐青霉素,AM P+)液體培養(yǎng)基,28℃、150 r/m in搖床培養(yǎng)過夜,次日分別轉(zhuǎn)接于2份LB液體培養(yǎng)基,28℃、150 r/min培養(yǎng)至OD600值為0.5左右時(shí),一份將培養(yǎng)溫度迅速升高到42℃誘導(dǎo)E基因表達(dá),另一份于28℃繼續(xù)培養(yǎng)。每30 min取樣,利用分光光度計(jì)測定OD600值并通過菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算裂解效率。

1.2.2 人傷寒沙門菌 Ty21a感受態(tài)細(xì)胞的制備人傷寒沙門菌 Ty21a接種到LB液體培養(yǎng)基,37℃、200 r/min培養(yǎng)16 h,劃線接種到LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,挑取單菌落經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)轉(zhuǎn)接到100 m L的LB液體培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長中期,4℃、4 000 r/min離心10 min收集菌體,預(yù)冷無菌PBS(p H7.4)洗滌2次,離心收集菌體;預(yù)冷電轉(zhuǎn)培養(yǎng)基(0.5 mol/L山梨醇,0.5 mol/L甘露醇,10%葡萄糖,蒸餾水定容)洗滌2次,離心收集菌體;用1 m L預(yù)冷的電轉(zhuǎn)培養(yǎng)基重懸菌體,100μL分裝,保存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 電擊轉(zhuǎn)化 Ty21a感受態(tài)細(xì)胞 取100μL Ty21a感受態(tài)細(xì)胞于冰浴中解凍,加入1μg質(zhì)粒pMBE,充分混合后注入預(yù)冷的0.1 cm無菌電擊杯(B IO-RAD)中,選擇電擊電阻與電容分別為200Ω與25μF,電擊轉(zhuǎn)化電壓選擇250 V、500 V和1 KV進(jìn)行比較。電擊儀(BIO-RAD Gene Xcell)內(nèi)轉(zhuǎn)化完成后,將轉(zhuǎn)化菌迅速吸出并加入3 m L空白LB培養(yǎng)基中,28 ℃、100 r/min搖床復(fù)蘇約 2 h,涂布AM P+抗性LB平板,28℃孵育培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),并比較轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化子通過菌落PCR進(jìn)行鑒定并測序。

1.2.4 人傷寒沙門菌 Ty21a菌蛻的制備 將重組Ty21a(pMBE)菌接種于AM P+抗性LB液體培養(yǎng)基中,28℃、150 r/min搖床培養(yǎng)過夜,次日轉(zhuǎn)接于2份100 m L的LB液體培養(yǎng)基,28℃、150 r/min培養(yǎng)至OD600值為0.4左右時(shí),一組將培養(yǎng)溫度迅速升高到42℃誘導(dǎo) E基因表達(dá),另一組于28℃繼續(xù)培養(yǎng)。每30 min取樣測定OD600值,同時(shí)留取1 m L菌液用于裂解效率測定,培養(yǎng)3～4 h,至OD600值基本保持不變時(shí),離心收集菌體,PBS洗滌后備用。

1.2.5 Ty21a菌蛻裂解效率測定 分別取裂解前,裂解后 1 h、2 h、3 h、4 h 和 5 h 的菌體(1 mL),用無菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋,涂布于AM P+抗性LB平板,28℃培養(yǎng)約22 h,計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)、各稀釋度下的活菌數(shù)(CFU),選擇某一稀釋度進(jìn)行裂解效率的計(jì)算。裂解效率=[1-(誘導(dǎo)后的CFU/誘導(dǎo)前的CFU)]×100%。

1.2.6 Ty21a菌蛻的電鏡觀察 取 Ty21a菌蛻細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌3次,3%戊二醛重懸,4℃固定過夜,乙醇逐級(jí)脫水,乙酸戊二酯置換,干燥后噴金,掃描電鏡(H ITACH I)下觀察、照相。取 Ty21a菌蛻細(xì)胞經(jīng) PBS洗滌3次,經(jīng) 3%戊二醛固定后,1/15 mol/L p H 7.2磷酸鹽緩沖液洗滌3次,1%鋨酸后固定,梯度乙醇脫水,Epon 812浸透包埋,制成常規(guī)超薄切片,經(jīng)醋酸鈾-檸檬酸鉛染色后在透射電鏡(Philip)下觀察。

2 結(jié) 果

2.1 裂解質(zhì)粒pBV E和pMBE介導(dǎo)大腸桿菌DH5α裂解效率比較 將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌 E.coli(pBVE)和 E.coli(pMBE)在28℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長中期,溫度迅速升至42℃誘導(dǎo) E基因的表達(dá),二者均于誘導(dǎo)后大約1 h時(shí)OD600值迅速下降,3 h后基本無變化。而28℃培養(yǎng)的 E.coli(pBVE)、E.coli(pMBE)和 E.coli DH 5α的OD600值均持續(xù)上升,見圖1。其中 E.coli(pMBE)裂解前的菌液CFU為56×105,而裂解后的菌液 CFU為7×100,其裂解效率為99.99%;重組 E.coli(pBVE)裂解前的菌液CFU為72×105,而裂解后的菌液 CFU為 80×104,其裂解效率為88.89%。結(jié)果表明,重組裂解質(zhì)粒pMBE介導(dǎo)的大腸桿菌DH5α的裂解效率較pBVE高,因此,我們選擇裂解質(zhì)粒pMBE用于人傷寒沙門菌Ty21a菌蛻的制備。

圖1 裂解 pBVE和pM BE介導(dǎo) E.coli HD5αFig.1 Growth and lysiscurves of E.coli DH5 harboring plasm id pBVEand pM BE A:pMBE、42℃;B:pMBE、28℃;C:pBVE、42℃;D:pBVE、28 ℃;D:E.coli DH5α、28 ℃

2.2 不同電擊條件對(duì)人傷寒沙門菌 Ty21a轉(zhuǎn)化效率的影響 采用不同的電擊電壓進(jìn)行 Ty21a菌的轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化完成后將全部培養(yǎng)物涂布于AM P+抗性的LB平板,28℃孵育培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次,計(jì)數(shù)結(jié)果見表1。結(jié)果顯示,電壓1 KV時(shí),細(xì)胞大量死亡;電壓250 V和500 V時(shí),均能實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒順利轉(zhuǎn)化,然而后者轉(zhuǎn)化效率稍高于前者,二者無顯著差異。由此,電壓500 V、電阻200 Ω、電容25μF應(yīng)是最佳轉(zhuǎn)化方案。

2.3 重組 Ty21a(pMBE)的鑒定 將電擊轉(zhuǎn)化后的重組 Ty21a(pMBE)經(jīng) PCR擴(kuò)增 E裂解基因片段,1%瓊脂糖凝膠電泳,條帶大小約276 bp,見圖2,測序結(jié)果顯示序列正確,說明質(zhì)粒pMBE已成功轉(zhuǎn)入 Ty21a菌中。

表1 不同電擊電壓下轉(zhuǎn)化效率比較Table 1 Effect of voltage on transformation efficiency

圖2 重組Ty21a(pMBE)E基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Identification of Gene E from recombinant Ty21a(pMBE)by PCR M:DL2000 DNA;1-2:Samp le;3:pMBE;4:Negative control

2.4 Ty21a菌蛻裂解效率測定 經(jīng)鑒定正確的重組 Ty21a菌(pMBE)在28℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長中期,將培養(yǎng)物分為兩份,一份溫度迅速升至42℃誘導(dǎo)細(xì)菌裂解,另一份于28℃繼續(xù)培養(yǎng)。在42℃誘導(dǎo)下1 h已開始溶菌,4 h時(shí)裂解最充分,見圖3。菌落計(jì)數(shù)結(jié)果顯示重組 Ty21a菌(pMBE)裂解前的菌液CFU為90×105,而裂解后的菌液CFU為3×105,裂解效率達(dá)96.77%。

圖3 Ty21a菌蛻的裂解曲線Fig.3 Growth and lysis curves of Ty21a harboring plasm id pMBE

2.5 Ty21a菌蛻掃描電鏡及透射電鏡觀察 絕大多數(shù)細(xì)菌在誘導(dǎo)后形成菌蛻,呈空泡狀結(jié)構(gòu),并能看到溶菌孔道,直徑介于200～400 nm之間(圖4-A和圖4-B)。菌蛻保留了完整的細(xì)菌外膜,但因?yàn)榘麅?nèi)物質(zhì)被釋放出去,細(xì)菌發(fā)生明顯皺縮(圖4-C和圖4-D)。

圖4 Ty21a菌蛻的掃描電鏡和透射電鏡結(jié)果Fig.4 Scanning and transmission dlectron micrograph of Ty21a lysed by the introduction of the lysis gene E.A:Control SEM;B:BG TEM;C:Control TEM;D:BG TEM

3 討 論

減毒沙門菌是一種具有宿主特異性的胞內(nèi)侵襲菌,能穿過腸壁,進(jìn)入腸道淋巴結(jié),再由淋巴循環(huán)進(jìn)入血液,并迅速感染單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞,并在包括肝、脾等組織內(nèi)復(fù)制生長,是腸道免疫的有效細(xì)菌載體[12-15]。Levine MM等用人傷寒沙門 Ty21a疫苗株進(jìn)行臨床試驗(yàn)證實(shí),人傷寒沙門 Ty21a疫苗株在人體試驗(yàn)中是安全的[16]。但其仍然存在一些不容忽視的問題,其中之一是存在毒力回復(fù),從而對(duì)機(jī)體造成損傷[17]。因此,本研究通過溫控誘導(dǎo)表達(dá)技術(shù)制備 Ty21a菌蛻,所制備菌蛻不但維持其完整的外膜結(jié)構(gòu),從而保留了其靶向到腸黏膜抗原遞呈細(xì)胞的特性;而且,在菌蛻制備過程中,細(xì)菌中的大部分胞內(nèi)物質(zhì)尤其是核酸被釋放,從而菌株毒力回復(fù)的可能性消除,使其安全性大大提高。

為了能夠有效獲得 Ty21a菌蛻,我們首先將不含RepA復(fù)制調(diào)控元件的裂解質(zhì)粒pBVE轉(zhuǎn)化Ty21a,結(jié)果表明,雖然裂解質(zhì)粒pBVE成功地轉(zhuǎn)化至 Ty21a,但誘導(dǎo) Ty21a的裂解效率極低(數(shù)據(jù)未給出),不能用于 Ty21a菌蛻的制備。因此,我們?cè)谫|(zhì)粒pBVE的基礎(chǔ)上引入了幽門螺桿菌RepA復(fù)制調(diào)控元件,構(gòu)建重組裂解質(zhì)粒pMBE。RepA復(fù)制調(diào)控元件所編碼的 RepA蛋白,是pSC101等復(fù)制子的調(diào)節(jié)分子,是一種順式作用蛋白,它對(duì)質(zhì)粒復(fù)制的起始具有正向作用,而對(duì)其自身基因的轉(zhuǎn)錄具有負(fù)調(diào)控作用[18]。結(jié)果表明,裂解質(zhì)粒pMBE不但介導(dǎo)大腸桿菌的裂解效率顯著高于pBVE,并且能有效介導(dǎo)人傷寒沙門桿菌 Ty21a的裂解,保證了Ty21a菌蛻的成功制備。

制備 Ty21a菌蛻的另一關(guān)鍵因素是如何保證裂解質(zhì)粒有效轉(zhuǎn)化至菌體。雖然人傷寒沙門菌與大腸桿菌同為革蘭氏陰性桿菌,但二者在結(jié)構(gòu)上存在差別,我們嘗試應(yīng)用不同的化學(xué)轉(zhuǎn)化方法均未能實(shí)現(xiàn) Ty21a的成功轉(zhuǎn)化(數(shù)據(jù)未給出)。因此本研究采用電擊轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行裂解質(zhì)粒pMBE的轉(zhuǎn)化。電擊電壓是電擊轉(zhuǎn)化的一個(gè)重要影響因素。電壓過高,往往導(dǎo)致細(xì)胞過多死亡;電壓不足,則細(xì)胞不宜極化產(chǎn)生微孔通道,無法實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化[19]。在參考文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于沙門菌相關(guān)電擊轉(zhuǎn)化電壓的基礎(chǔ)上[20],進(jìn)行了不同電擊轉(zhuǎn)化條件的摸索。結(jié)果表明,電壓500 V、電阻200Ω、電容25μF獲得了理想的轉(zhuǎn)化結(jié)果。

本研究運(yùn)用溫控表達(dá)系統(tǒng)控制噬菌體PhiX174 E裂解基因的表達(dá),實(shí)現(xiàn) Ty21a菌裂解,獲得了穩(wěn)定制備Ty21a菌蛻的方法。當(dāng)誘導(dǎo)溫度升至42℃時(shí)1 h已開始溶菌,4 h菌液開始變得澄清,經(jīng)菌落計(jì)數(shù)顯示裂解效率達(dá)96.77%。所制備的 Ty21a菌蛻經(jīng)掃描電鏡和透射電鏡觀察,菌蛻保留了完整的外膜結(jié)構(gòu),絕大多數(shù)呈空泡狀結(jié)構(gòu),并且裂解通道清晰可見。從而為下一步以其作為疫苗和藥物等遞送體系的研究奠定了基礎(chǔ)。

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Preparation and identification of Salmonella enterica Ty21a bacterial ghosts

WEN Jing,KOU Zhi-hua,YU Hong,LüXing-ru,WANG Xin,Guo Yan,YU Jian-ping,ZHAO Guang-yu,ZHOU Yu-sen

(State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity,Beijing Institute of Microbiology and Epidem iology,Beijing 100071,China)

In order to prepare Ty21a bacterial ghosts accomplished by the temperature-controlled expression of bacteriophage PhiX174 lys is gene E,two recombinant lysis plasmidswere constructed by cloning the lysis gene E into temperature-induced plasmid system,and their lysis efficiency to E.coli DH5αwas compared by counting the colony forming unit(CFU).Plasmid pMBE was transformed into bacteria Ty21a using imp roved transformation condition,then Ty21a bacterial ghosts(Ty21a BGs)were produced by shifting the temperature from 28℃to 42℃.Ty21a BGswere harvested by centrifugation,and the lysis rate was calculated.The characterization of BG was observed by scanning electron micrograph(SEM)and transmission electron micrograph(TEM).The lysis rate of E.coli ghosts which were induced by plasmid pMBE was about 99.99%.Bacteria Ty21a was efficiently transformed using optimal electro poration parameters(voltage 500V,electric resistance 200Ω,and capacitance 25μF),forming recombinant Ty21a(pMBE).Ty21a BGs were produced by controlled expression of PhiX174 lysis gene E,and the lysis rate was 96.77%.Ghosts show loss of cytoplasmic material and structural integrity.The Ty21a bacterial ghost was successfully produced by the controlled expression of PhiX174 lysis gene E,which provides an efficient delivery system for vaccine development.

Ty21a;bacterial ghost;electroporation condition;PhiX174 lysis gene E

R378.2

A

1002-2694(2011)06-0479-05

＊國家自然科學(xué)基金(30872392)和863課題(2007AA02Z414)聯(lián)合資助

寇志華,Email:zh_69kou@yahoo.com;周育森,Email:yszhou@nic.bmi.ac.cn

北京微生物流行病研究所,病原微生物生物安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100071

2011-01-10;

2011-03-02