孟艷芬,段長(zhǎng)松,王錫樂,熊小路,溫博海

黑龍江立克次體感染血管內(nèi)皮細(xì)胞的初步研究＊

孟艷芬,段長(zhǎng)松,王錫樂,熊小路,溫博海

目的 通過黑龍江立克次體感染體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endo thelial cells,HUVEC)探討其在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)規(guī)律。方法將泛影葡胺密度梯度超速離心純化的黑龍江立克次體(HLJ-054株)感染體外培養(yǎng)的 HUVEC,通過間接免疫熒光和掃描電鏡檢測(cè)與觀察不同時(shí)相黑龍江立克次體在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)狀況。熱滅活黑龍江立克次體做平行對(duì)照。結(jié)果立克次體粘附并侵入內(nèi)皮細(xì)胞,在感染后第6 h及第24 h分別為感染高峰;感染5 d后細(xì)胞內(nèi)立克次體逐漸增殖,第8～9 d細(xì)胞內(nèi)立克次體急劇增殖,并見細(xì)胞核內(nèi)有少量立克次體,細(xì)胞出現(xiàn)病變,第12 d細(xì)胞內(nèi)充滿立克次體,大部分細(xì)胞皺縮脫落。結(jié)論黑龍江立克次體能夠感染血管內(nèi)皮細(xì)胞,在血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)不斷增殖而使細(xì)胞死亡。

黑龍江立克次體;血管內(nèi)皮細(xì)胞;細(xì)胞病變

立克次體屬為α-變形菌綱(α-p roteobacteria)的一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭陰性菌,分為斑點(diǎn)熱群(Spotted fever group,SFG)和斑疹傷寒群(Typhus group,TG),分別引起斑點(diǎn)熱和斑疹傷寒。斑點(diǎn)熱是重要的人獸共患病,經(jīng)典的斑點(diǎn)熱有立氏立克次體引起的落磯山斑點(diǎn)熱、康氏立克次體引起的地中海斑點(diǎn)熱(鈕扣熱)、西伯利亞立克次體引起的北亞熱、澳大利亞立克次體引起的昆士蘭斑點(diǎn)熱、小蛛立克次體引起的立克次體痘等[1-2]。近30年來在世界各地新發(fā)現(xiàn)了10多種斑點(diǎn)熱立克次體,我國(guó)已在至少10多個(gè)省、市、自治區(qū)證實(shí)有斑點(diǎn)熱立克次體感染,并從新疆、內(nèi)蒙古、黑龍江、吉林、北京等地的病人和/或蜱體內(nèi)分離到斑點(diǎn)熱立克次體[3],分子生物學(xué)研究證實(shí)從新疆、內(nèi)蒙古、北京分離的斑點(diǎn)熱立克次體為西伯利亞立克次體,而從黑龍江、吉林分離的立克次體為——斑點(diǎn)熱立克次體新種——黑龍江立克次體(Rickettsia heilongjiangensis)[4]。

黑龍江立克次體是我國(guó)1982年首先從黑龍江綏芬河的森林革蜱(Derm acentor silvarum)分得的一斑點(diǎn)熱群立克次體新種,1996年又從東北病人血液首次分離到該病原體,證實(shí)其對(duì)人的致病性。2003年俄羅斯亦發(fā)現(xiàn)黑龍江立克次體感染的急性蜱傳斑點(diǎn)熱患者和從蜱樣本中擴(kuò)增到該立克次體DNA[5-6]。黑龍江立克次體引起的蜱傳斑點(diǎn)熱被WHO命名為“遠(yuǎn)東蜱傳斑點(diǎn)熱”[7],為新發(fā)現(xiàn)的人獸共患病。

斑點(diǎn)熱立克次體可以在體外培養(yǎng)的真核細(xì)胞(上皮細(xì)胞如綠猴腎上皮細(xì)胞即Vero細(xì)胞,成纖維細(xì)胞如雞胚成纖維細(xì)胞,內(nèi)皮細(xì)胞及造血細(xì)胞系等)內(nèi)生長(zhǎng)繁殖,但其在體內(nèi)主要侵犯血管內(nèi)皮細(xì)胞[8-9]。斑點(diǎn)熱的發(fā)病主要是由攜帶立克次體的蜱直接叮咬皮膚,進(jìn)入體內(nèi),首先侵染血管內(nèi)皮細(xì)胞。斑點(diǎn)熱立克次體通過其表面外膜蛋白A和B(rOmpB和 rOmp A)與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面受體Ku70結(jié)合而侵入血管內(nèi)皮細(xì)胞。斑點(diǎn)熱立克次體在宿主細(xì)胞質(zhì)內(nèi)生長(zhǎng)繁殖,以其RickA蛋白誘導(dǎo)宿主細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白聚合形成肌絲,推動(dòng)立克次體從細(xì)胞內(nèi)釋放感染相鄰細(xì)胞,引起血管損傷[8-12]。斑點(diǎn)熱立克次體感染的臨床表現(xiàn)主要由全身血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷所致,引起急性血管炎、血管周圍炎及相應(yīng)器官病變。

微血管內(nèi)皮細(xì)胞為斑點(diǎn)熱群立克次體的靶細(xì)胞。本文采用體外分離培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human um bilical vein endo the lial cells,HUVEC)作為黑龍江立克次體的宿主細(xì)胞,通過間接免疫熒光抗體染色檢測(cè)和掃描電鏡觀察,分別測(cè)定不同時(shí)相黑龍江立克次體在宿主內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量,分析黑龍江立克次體感染內(nèi)皮細(xì)胞及其在內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖規(guī)律,為進(jìn)一步研究黑龍江立克次體的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 黑龍江立克次體054株感染雞胚卵黃囊膜,為本室保存。

1.1.2 感染血清 黑龍江立克次體054株感染BALB/c小鼠21 d血清。

1.1.3 細(xì)胞 Vero細(xì)胞由本室保存,HUVEC由本室分離、培養(yǎng)。

1.1.4 細(xì)胞培養(yǎng)液 RPM I-1640培養(yǎng)液(Hy-Clone),胎牛血清(HyClone),膠原酶Ⅰ型(Gibco),0.25%胰蛋白酶(HyClone),內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液及內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑(ScienCell),青、鏈霉素(Hy-Clone)、NaHCO3(HyClone),HEPES(HyClone),腦心浸液(Becton Dickinson)。

1.2 方法

1.2.1 黑龍江立克次體培養(yǎng)及純化[13]復(fù)蘇Vero細(xì)胞,加入含10%胎牛血清的 RPM I-1640培養(yǎng)液(p H 7.2),置37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)長(zhǎng)至細(xì)胞單層,分瓶傳代培養(yǎng)。用3.7%腦心浸液研磨黑龍江立克次體感染的雞胚卵黃囊膜,制備適當(dāng)濃度的卵黃囊膜懸液,用10%懸液感染C3H/HeN小鼠,第3 d取小鼠脾臟,研磨成細(xì)胞懸液,200鉬銅網(wǎng)過濾后感染無青、鏈霉素培養(yǎng)液(含2%～5%FBS)培養(yǎng)的Vero細(xì)胞單層,感染24 h后棄上清,加入新鮮培養(yǎng)基,置33 ℃、5%CO2孵箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)5～7 d,倒置顯微鏡下見細(xì)胞單層出現(xiàn)空斑,Giménez染色檢測(cè)可見Vero細(xì)胞內(nèi)黑龍江立克次體散在分布。將傳代擴(kuò)大培養(yǎng)的正常Vero細(xì)胞與黑龍江立克次體感染的Vero細(xì)胞混懸共培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞內(nèi)黑龍江立克次體感染嚴(yán)重時(shí)富集細(xì)胞。富集的Vero細(xì)胞,經(jīng)玻璃珠破碎,3 000 r/min離心20 min去除細(xì)胞碎片,17 000 r/min離心1 h富集黑龍江立克次體。將富集的黑龍江立克次體制成懸液,過泛影葡胺密度梯度,超速離心后得到純化的黑龍江立克次體,分裝并保存于-70℃冰箱備用?？瞻哂?jì)數(shù)定量純化的活的黑龍江立克次體[14-16],為 1.2×107PFU/m L。

1.2.2 HUVEC培養(yǎng)[17]將正常產(chǎn)后6h內(nèi)、健康新生兒臍帶放入含1%青、鏈霉素的無菌 PBS中,4℃保存。在生物安全柜,剪除臍帶破損、夾痕、血腫部分,臍靜脈一端插入與三通管接通的平針頭,用止血鉗固定,PBS沖洗臍靜脈至無血跡。臍靜脈另一端用止血鉗夾閉固定,向臍靜脈內(nèi)灌注0.1%Ⅰ型膠原酶溶液,使臍靜脈完全充盈,37℃水浴孵育15～20 m in。孵育完畢,收集臍靜脈內(nèi)消化液,用PBS沖洗臍靜脈1次,將洗液一并收集到50 m L離心管。1 200 r/m in離心10 min,棄上清,洗細(xì)胞1遍,向細(xì)胞沉淀中加入內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液(含5%胎牛血清、內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液 ECM、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑 ECGS 100 U/m L青霉素、100μg/mL鏈霉素),用吸管輕輕吹打制成均勻的細(xì)胞懸液,接種于25 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶,置37 ℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)24 h換新鮮培養(yǎng)液,以后每2～3 d換液。原代培養(yǎng)的 HUVEC長(zhǎng)滿培養(yǎng)面80%以上時(shí),棄細(xì)胞上清,用PBS洗細(xì)胞1遍,用1 m L 0.25%胰蛋白酶室溫消化2～3 min后棄胰蛋白酶,加入含血清的培養(yǎng)液終止胰酶消化。用吸管輕輕吹打使貼壁細(xì)胞完全脫落,收集細(xì)胞懸液,1 200 r/min離心10 min后棄上清,加入內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)。

1.2.3 黑龍江立克次體感染 HUVEC 將3代培養(yǎng)的HUVEC作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。消化 HUVEC單層細(xì)胞成懸液,接種至鋪有蓋玻片的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,待 HUV EC在蓋玻片上長(zhǎng)至單層,分別用活或熱滅活的黑龍江立克次體與 HUV EC(MO I=200∶1)共培養(yǎng),置33 ℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后棄細(xì)胞上清,再加入細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。分別在此后1～24 h及 2～12 d取出蓋玻片,用黑龍江立克次體感染小鼠21 d血清作間接免疫熒光檢測(cè)(IFA),計(jì)算黑龍江立克次體感染指數(shù)及評(píng)價(jià)黑龍江立克次體在內(nèi)皮細(xì)胞的增殖水平。黑龍江立克次體感染指數(shù)=每個(gè)細(xì)胞含立克次體均數(shù)×感染細(xì)胞百分率×100[18]。

1.2.4 掃描電鏡觀察 于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板取出立克次體感染 1 d、3 d、5 d、9 d、12 d 的內(nèi)皮細(xì)胞蓋玻片,浸入PBS輕輕洗細(xì)胞表面,將細(xì)胞蓋玻片放入含有固定劑的小瓶,在4℃固定2 h;吸出固定劑,PBS輕洗2次(每次10 min),再用預(yù)冷的10 g/L鋨酸在4℃固定1 h;用 PBS輕洗2次后用系列梯度乙醇脫水(乙酸異戊酯置換),經(jīng) CO2臨界點(diǎn)干燥后將細(xì)胞片置掃描電鏡觀察內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)立克次體。

2 結(jié) 果

2.1 黑龍江立克次體感染 HUV EC 用純化的活黑龍江立克次體感染爬片生長(zhǎng)的 HUVEC,分別在第 1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h 取出蓋玻片 ,IFA 檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)立克次體,結(jié)果顯示1～3 h內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)立克次體感染數(shù)較少,僅有約10%細(xì)胞感染,平均每個(gè)細(xì)胞內(nèi)含黑龍江立克次體<1;在感染后6 h和24 h時(shí),各出現(xiàn)一個(gè)感染高峰,IFA檢測(cè)顯示感染后第24 h約85%內(nèi)皮細(xì)胞被感染。滅活黑龍江立克次體與內(nèi)皮細(xì)胞共同培養(yǎng),結(jié)果顯示內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)立克次體數(shù)亦無明顯增加(圖1A)。

圖1 黑龍江立克次體感染內(nèi)皮細(xì)胞效率(A)及黑龍江立克次體在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)曲線(B)Fig.1 R.heilong jiangensis infected HUVECs during 24 hours(A)and grew in HUVECs during 12 days(B)

2.2 黑龍江立克次體在 HUVEC內(nèi)生長(zhǎng) 黑龍江立克次體以感染爬片生長(zhǎng)的 HUV EC 24 h后棄細(xì)胞上清,加入新的細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。將立克次體感染內(nèi)皮細(xì)胞24 h定為0 d,其后每天取感染細(xì)胞熒光染色鏡檢。感染后第1 d,平均每個(gè)細(xì)胞內(nèi)含

5～10個(gè)立克次體;感染后第1～4 d,細(xì)胞內(nèi)立克次體未見明顯增殖,但第5～7 d細(xì)胞內(nèi)立克次體數(shù)逐漸增加,宿主細(xì)胞未見明顯病變;第8～9 d細(xì)胞內(nèi)立克次體急劇增加,并可見細(xì)胞胞核內(nèi)有少量立克次體;第12 d胞質(zhì)內(nèi)彌漫立克次體,細(xì)胞由梭形變成瘦長(zhǎng)形(圖1B;圖2);第15 d,大部分細(xì)胞皺縮脫落或破碎,懸浮細(xì)胞及碎片染色鏡檢可見大量立克次體。滅活黑龍江立克次體與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng),染色鏡檢僅見細(xì)胞內(nèi)含極少量立克次體,第5～7 d細(xì)胞內(nèi)基本觀察不到立克次體。

2.3 掃描電鏡觀察黑龍江立克次體感染 HUVEC黑龍江立克次體感染細(xì)胞后1～3 d,可見立克次體存在于內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)中,當(dāng)立克次體進(jìn)入胞質(zhì),以游離狀態(tài)分散于胞質(zhì)內(nèi),菌體外周有一層電子密度低的“環(huán)帶”將立克次體與宿主細(xì)胞胞質(zhì)分隔開。感染5 d后,立克次體感染細(xì)胞增多,細(xì)胞內(nèi)立克次體數(shù)量明顯增加,立克次體感染細(xì)胞胞膜形成突觸,相鄰受感染的細(xì)胞胞膜凹陷將立克次體攝入胞質(zhì)。處于分裂狀態(tài)的立克次體長(zhǎng)短不等,呈桿狀、棒狀,均以二分裂方式繁殖,還可見立克次體互相縱行連接成鏈狀結(jié)構(gòu),鏈狀結(jié)構(gòu)可含有3個(gè)或4個(gè)形態(tài)相似的立克次體。電鏡下觀察到細(xì)胞胞核內(nèi)存在立克次體,胞核內(nèi)立克次體一般出現(xiàn)在感染5d后的細(xì)胞內(nèi)(圖 3)。

3 討 論

斑點(diǎn)熱立克次體的宿主細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞,為了研究黑龍江立克次體與宿主內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用,我們分離、培養(yǎng)原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,傳代培養(yǎng)3代的內(nèi)皮細(xì)胞作為黑龍江立克次體感染宿主細(xì)胞。用黑龍江立克次體感染內(nèi)皮細(xì)胞24 h后,去除細(xì)胞上清,添加新鮮無青、鏈霉素的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液,觀察黑龍江立克次體感染內(nèi)皮細(xì)胞及其在內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖規(guī)律。結(jié)果顯示黑龍江立克次體與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)24 h內(nèi),在第6 h及第24 h各出現(xiàn)一個(gè)感染高峰,與在3～7 h和24 h各出現(xiàn)一個(gè)感染高峰的立氏立克次體感染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)果基本一致[19]。

圖2 IFA檢測(cè)黑龍江立克次體感染內(nèi)皮細(xì)胞A:感染后12 h,內(nèi)皮細(xì)胞攝入立克次體;B:感染5d后,細(xì)胞內(nèi)立克次體逐漸增多,但內(nèi)皮細(xì)胞繼續(xù)分裂增殖;C:立克次體呈棒狀,處于即將分裂狀態(tài);D:少量立克次體進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞胞核內(nèi);E:感染后9 d,立克次體互相縱行連接成鏈狀結(jié)構(gòu),鏈狀結(jié)構(gòu)可含有3個(gè)或4個(gè)立克次體;F:感染后10 d,細(xì)胞由梭形變成瘦長(zhǎng)形,含大量立克次體。Fig.2 R.heilong jiangensis infected HUVECs revealed by indirect immunofluorescence assay A:internalization of rickettsiae by the endothelial cell at 12h postinfection;B:cell proliferation with more rickettsiae;C:long rod-shape forms of rickettsiae thatwould divided;D:transmitted and entry into the nuclei of rickettsiae;E:rickettsiae formed a chain-shape by three o r four organism s in cytop lasm on day 9 postinfection;F:HUVECs became long and thin with high load of rickettsiae

黑龍江立克次體進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞后,能夠在內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖,并且維持較長(zhǎng)的增殖時(shí)間。為了解黑龍江立克次體在內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)規(guī)律,本研究用IFA及掃描電鏡觀察,分析黑龍江立克次體在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)12 d的生長(zhǎng)繁殖規(guī)律。從感染后第1 d到第4 d,黑龍江立克次體在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)無顯著增殖,IFA檢測(cè)可見細(xì)胞內(nèi)少量立克次體散在分布于細(xì)胞質(zhì)。第5～9 d立克次體在內(nèi)皮細(xì)胞以二分裂方式快速增殖,立克次體數(shù)量急劇增加,并且內(nèi)皮細(xì)胞核

圖3 掃描電鏡觀察黑龍江立克次體感染內(nèi)皮細(xì)胞A:立克次體從感染細(xì)胞釋放感染鄰近細(xì)胞;(B,C):位于胞內(nèi)的立克次體外周包裹低密度物質(zhì),正在分裂及分裂形成鏈狀排列的立克次體;(D,E):3 000倍及1 500倍電鏡下立克次體分布在胞質(zhì)及胞核;F:內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)皺縮,立克次體密集成團(tuán)。Fig.3 R.heilong jiangensis infected HUVEC observed under scanning electron m icrographs(SEM)A:rickettsiae sp read from the infected cells to normal cells;(B,C):intracellular rickettsiae coated with low electron density materials;(D,E):intracellular rickettsiae p roliferated and formed chains;rickettsiae existed in cytop lasm and nuclei at low power of SEM(E);F:an intensive cluster of rickettsiae was observed in cytoplasm at high power of SEM.

內(nèi)出現(xiàn)立克次體侵入,立克次體在內(nèi)皮細(xì)胞大量增殖,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)無明顯改變,IFA及掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)黑龍江立克次體使細(xì)胞形成突觸釋放感染相鄰細(xì)胞,即通過細(xì)胞間播散感染相鄰細(xì)胞。第10 d檢測(cè),內(nèi)皮細(xì)胞由梭形貼壁伸展生長(zhǎng)逐漸呈瘦長(zhǎng)形,胞質(zhì)內(nèi)充滿立克次體,每個(gè)細(xì)胞內(nèi)立克次體超過100個(gè),細(xì)胞核內(nèi)立克次體亦有增多。感染后第12 d,大部分內(nèi)皮細(xì)胞變圓脫落,懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)基,將脫落的內(nèi)皮細(xì)胞離心甩片做 IFA檢測(cè),可見內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)有大量立克次體,并可見內(nèi)皮細(xì)胞碎片及碎片中也帶有立克次體,在細(xì)胞上清中也發(fā)現(xiàn)大量立克次體。這是由于立克次體在細(xì)胞內(nèi)大量繁殖致使細(xì)胞裂解,立克次體釋放到細(xì)胞上清中。

立克次體病是一類嚴(yán)重威脅人類健康的人獸共患自然疫源性疾病。斑點(diǎn)熱群立克次體是以侵犯血管內(nèi)皮細(xì)胞為主使人致病的細(xì)胞內(nèi)寄生病原菌。斑點(diǎn)熱群立克次體感染微血管內(nèi)皮細(xì)胞,首先要接觸、粘附內(nèi)皮細(xì)胞,然后侵入內(nèi)皮細(xì)胞,但其機(jī)制值得進(jìn)一步研究。黑龍江立克次體是我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)的斑點(diǎn)熱群立克次體新種,我們也將采用新的技術(shù)和方法進(jìn)一步研究黑龍江立克次體如何與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用,發(fā)現(xiàn)我國(guó)斑點(diǎn)熱立克次體的致病相關(guān)毒力分子,在細(xì)胞和分子水平上進(jìn)一步闡明黑龍江立克次體致病機(jī)理。

[1]Walker DH.Rickettsiae and Rickettsial Infections:The current state of know ledge[J].Clin Infect Dis,2007,45:39-44.

[2]Walker DH,Ismali N.Emerging and re-emerging rickettsioses:endothelial cell infection and early disease events[J].Nature,2008,6:375-386.

[3]俞樹榮,陳香蕊.立克次體與立克次體病[M].北京:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社,1999:33-59.

[4]張軍,焦艷梅,陳梅玲,等.基于ompB基因序列的立克次體精河株的系統(tǒng)發(fā)育分析與鑒定[J].寄生蟲與醫(yī)學(xué)昆蟲學(xué)報(bào),2007,14:24-28.

[5]Foumier PE,Dum ler JS,Greub G,et al.Gene sequence-based criteria for identification of new rickettsia isolates and description of Rickettsa beilongiiangsis sp,nov[J].JClin Microbiol,2003,41:5456-5465.

[6]吳益民,魏安明,胡玲美,等.從患者血液分離的斑點(diǎn)熱群立克次體HLJ-H5株的鑒定[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)雜志,1998,14:23-26.

[7]Mediannikov OY,Sidelnikov Y,Ivanov L,et al.Acute tickebome rickettsiosis caused by Rickettsia heilongiangensis in Russian far east[J].Emerg Infect Dis,2004,10:810-817.

[8]Olanno JP.Rickettsial infections[J].ANN N Y Acad Sci,2005,1063:187-196.

[9]Valbuena G,Walker DH.The endothelium as a target for infections[J].Annu Rev Pathol,2006,1:171-198.

[10]Balraj P,Nappez C,Raoult D,et al.Western-blot detection of Rick A within spotted fever group rickettsiae using a specific monoclonal antibody[J].FEMS Microbiol Lett,2008,286(2):257-262.

[11]Martinez JJ,Seueau S,Veiga E,et al.Ku 70,a component of DNA-dependent protein kinase,is a mammalian receptor for rickettsia conorii[J].Cell,2005,123:1013-1023.

[12]Walker TS.Rickteesial interactions with human endothelial cell in vitro:adherence and entry[J].Infect Immun,1984,44:205-210.

[13]Ammerman NC,Beier-Sexton M,Azad AF.Laboratory Maintenance of Rickettsia rickettsii[J].Curr Protoc Microbiol,2008,3:Unit 3A.5.1-3A.5.21.

[14]Weinberg EH,Stakebake JR,Gerone PJ.Plaque assay for Rickettsia ricketisii[J].JBacteriol,1969,98:398-402.

[15]Wike DA,Tallent G,Peacock M G,et al.Studies of the rickettsial plaque assay technique[J].Infect Immun,1972,5:715-722.

[16]M cDade JE,Stakebake JR,Gerone PJ.Plaque assay system for several species of Rickettsia[J].J Bacteriol,1969,99:910-912.

[17]Jaffe EA,Nachman RL,Kecker CG,et al.Culture of human endothelial cell derived from unbilical veins[J].J Clin Invest,1973,52:2745-2756.

[18]李麗莉,溫博海,張晶波,等.貝氏柯克斯體被單核細(xì)胞吞噬及其在單核細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)的初步研究[J].中國(guó)人獸共患病雜志,2005,21:940-944.

[19]Sporn LA,Sahni SK,Lerner NB,et al.Rickettsia rickettsii infection of cultured human endothelial cells induces NF-kappaB activation[J].Infect Immun,1997,65:2786-2791.

Primary study on Rickettsia heilong jiangensis infection of vascular endothelial cells

M ENG Yan-fen,DUAN Chang-song,WANG Xi-le,XIONG Xiao-lu,WEN Bo-hai

(State Key Laboratory of Pathogens and Biosecurity,Institute of Microbiology and Epidem iology,Beijing 100071,China)

The Rickettsia heilongjiangensis organisms purified by Renografin renografin gradient centrifugation were app lied to infected human umbilical vein endothelial cells(HUVEC)grow n in monolayer on cover slips.Rickettsiae were examined by both indirect immune fluorescence assay(IFA)and scanning electron micrograph(SEM)after rickettsial infection.During the first 24 hours postinfection(ip),two infection peaks were found at 6 and 24 hours pi,respectively.Multip lication of rickettsiae and pathological changes of host cells wereob served at 5 days pi,while the amount of intracellular rickettsiae was markedly increased within 5 to 9 days pi.A few of rickettsiae were observed in the nucleus of host cells that appeared severe pathological changes within 8 to 9 dayspi.Due to the overw helming rickettsial infection,most of the infected host cells shed 12 days pi.Our results demonstrated that R.heilong jiangensis has a capability to infect vascular endo the lial cells to cause vascular injury of humans.

Rickettsia heilong jiangensis;vascular endothelial cells;pathological change

R376

A

1002-2694(2011)06-0470-05

＊國(guó)家基礎(chǔ)研究計(jì)劃(973計(jì)劃課題 2010CB530200/2010CB530205)和國(guó)家科技重大專項(xiàng)(重大傳染病預(yù)防與控制課題2008ZX10004-002)聯(lián)合資助

溫博海,Email:bohaiwen@sohu.com

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100071

2011-03-02;

2011-03-22