單曉楓，吳同壘，孟慶峰，王偉利，錢愛東

維氏氣單胞菌吉林分離株外膜蛋白AⅡ基因的克隆及生物信息學(xué)分析＊

單曉楓1，吳同壘1，孟慶峰2，王偉利2，錢愛東1

目的 克隆維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii，AV）吉林株外膜蛋白AⅡ（OMPAⅡ）基因，并對其編碼蛋白進行生物信息學(xué)分析。方法根據(jù)維氏氣單胞菌已知OMPAⅡ基因序列設(shè)計合成一對引物，通過PCR技術(shù)擴增OMPAⅡ基因，并將其克隆到p MD18－T載體上，陽性重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定后進行序列測定，通過Blast N分析維氏氣單胞菌OMPAⅡ基因序列與其他菌種OMPAⅡ序列同源性，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，同時對維氏氣單胞菌OMPAⅡ蛋白進行生物信息學(xué)分析。結(jié)果克隆基因長1 001 bp，與GenBank報道的基因序列同源性為95%，生物信息學(xué)軟件分析OMPAⅡ蛋白無跨膜區(qū)，其N端含有1個信號肽，二級結(jié)構(gòu)以β折疊和β轉(zhuǎn)角為主，有10個區(qū)域可能存在B細胞抗原表位。結(jié)論成功的克隆維氏氣單胞菌OMPAⅡ基因，并對OMPAⅡ蛋白的相關(guān)生物信息學(xué)進行了分析。

維氏氣單胞菌；外膜蛋白AⅡ；克??；序列分析；生物信息學(xué)

維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii，AV）是1983年美國疾病預(yù)防與控制中心為紀(jì)念法國微生物學(xué)家Veron而將9株氣單胞菌屬的新種命名，其廣泛分布于水體與陸地環(huán)境中，可以感染多種恒溫及變溫動物，甚至感染人。做為一種新型水生動物病原菌，近年，已有相當(dāng)多的病例報道，感染水生動物的種類更是多樣［1－5］。而有關(guān)感染人的病例也有增多的趨勢，其可引起多種炎癥：胃腸炎、腦膜炎、敗血癥、腹膜炎等，甚至有報道稱AV可引起人的溶血性尿毒綜合癥和彌漫性血管溶栓［6－8］。AV做為一種新型的人－獸－魚共患病原菌，應(yīng)當(dāng)引起人們的足夠重視。已證實：AV的毒力因子包括氣溶素、內(nèi)毒素、外膜蛋白、粘附素、胞外蛋白酶等，其中，外膜蛋白在增強吞噬附著力、抵抗補體介導(dǎo)的血清殺傷力及參與細菌接合作用等方面均起著主要作用，且外膜蛋白有著較強的免疫原性，對其進行深入了解，將為AV疫苗的研究打下良好的基礎(chǔ)。

目前，國內(nèi)對AV的外膜蛋白尚無報道，基于此，本試驗克隆了AV吉林分離株的外膜蛋白AⅡ基因，并對其序列及編碼的蛋白進行了相應(yīng)的生物信息學(xué)分析，以期為AV基因工程疫苗的研究及建立可靠的檢測方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 菌種和載體 維氏氣單胞菌CY0806，分離自吉林某漁場框鏡鯉，由本實驗室保存；大腸桿菌DH5α，由本實驗室保存制備；p MD18－T載體，購自寶生物工程（大連）有限公司。

1．2 主要試劑 DL2000 Marker、Taq DNA 聚合酶、d NTP均購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購自愛思進生物技術(shù)有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；氣單胞菌培養(yǎng)基RS購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1．3 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank上發(fā)表的AV外膜蛋白AⅡ基因序列，用生物軟件Primer Premer 5．0設(shè)計一對特異性引物，上游引物P1：5′－GCTGAATTCATGAAACTCAAAATGGCTC－3′、下 游 引 物 P2：5′－GCGAAGCTTTTACTGTTGTACTTGC－3′，預(yù)計擴增片段長1 001 bp，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1．4 AV OMPAⅡ基因的PCR擴增 將低溫冷存的AVCY0806復(fù)蘇，并劃線接種于RS培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)24 h，挑取黃色單個菌落接種于普通LB液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)18 h，取1 m L菌液提取細菌基因組DNA，以該基因組DNA為模板，P1、P2為引物，50μL體系進行PCR擴增OMPAⅡ基因，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，59℃復(fù)性1 min，72℃延伸1．5 min，共34個循環(huán)；72℃延伸10 min。用1．0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗擴增產(chǎn)物。

1．5 AV OMPAⅡ基因的克隆及鑒定 PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢驗后用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段，并與p MD18－T載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中，平鋪于含氨芐青霉素LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取單個菌落增菌，提取質(zhì)粒DNA并進行PCR驗證。將篩選的陽性重組質(zhì)粒送至寶生物工程（大連）有限公司。

1．6 AV OMPAⅡ基因的序列分析及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建 利用NCBI的Blastn對測序結(jié)果進行比對，并從GenBank上下載不同菌種的OMPAⅡ基因的，應(yīng)用Mega4．0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1．7 AV OMPAⅡ基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析 以AV CY0806 OMPAⅡ基因完整開放閱讀框編碼的氨基酸序列為原始數(shù)據(jù)，選擇不同的生物信息學(xué)分析軟件對OMPAⅡ蛋白的分子量、理化參數(shù)、信號肽、跨膜區(qū)、二級結(jié)構(gòu)、B細胞抗原表位等進行預(yù)測分析。

2 結(jié) 果

2．1 AV OMPAⅡ基因的PCR擴增與鑒定 用2條特異性引物從AV CY0806基因組DNA中擴增出約1 000 bp的特異性條帶，片段大小與預(yù)期結(jié)果一致（圖1）；挑選的陽性克隆菌落提取質(zhì)粒通過PCR鑒定，得到與目的基因大小一致的片段（圖2）。

2．2 AV OMPAⅡ基因的序列分析與系統(tǒng)進化樹構(gòu)建 測定的AV OMPAⅡ基因的全長1 001 bp，預(yù)測編碼333個氨基酸，分子量35 034．4 u。以Blast N對獲得的OMPAⅡ基因序列進行同源性分析：該基因與維氏氣單胞菌AB290200和FJ711769 OMPAⅡ同源性為95%，與溫和氣單胞菌X91983、嗜水氣單胞菌AF146597同源性分別為82．6%和83%。與不同菌種的OMPAⅡ基因構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹如圖3所示。

圖3 AV OMPAⅡ基因的系統(tǒng)進化樹Fig．3 Phylogenetic tree of AV OMPAⅡgene

2．3 AV OMPAⅡ基因編碼蛋白生物信息學(xué)分析2．3．1 AV OMPAⅡ蛋白的分子特征 經(jīng)在線工具ProtParam tool分析：OMPAⅡ蛋白推測分子式C1559H2441N421O483S9，等電點為4．97，半衰期為30 h（體外哺乳動物類網(wǎng)狀細胞）、大于20 h（在酵母內(nèi)）、大于10 h（在大腸桿菌內(nèi)），不穩(wěn)定系數(shù)20．45，為穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)為89．43，總平均親水性為－0．042。

2．3．2 AV OMPAⅡ的信號肽與跨膜區(qū)分析 通過SignalP軟件預(yù)測：OMPAⅡ蛋白序列最前端的23個N－末端氨基酸殘基為信號肽序列，最佳切割位點在23－24個氨基酸（圖4）；TMHMM分析結(jié)果顯示：OMPAⅡ蛋白無跨膜區(qū)。

圖4 AV OMPAⅡ蛋白分子信號肽預(yù)測Fig．4 Signal peptide prediction of AV OMPAⅡ

2．3．4 AV OMPAⅡ的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析 以Garnier Robson方法預(yù)測OMPAⅡ的二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)：α螺旋占35．1%，β折疊占46．2%，在各α螺旋與β折疊間存在不同的β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲，其中β轉(zhuǎn)角占8．71%，無規(guī)則卷曲占10．8%；而應(yīng)用Chou－Fasman分析顯示：α螺旋占25．8%，β折疊占25．8%，二者相間分布，在β折疊之間存在大量β轉(zhuǎn)角，占36%（圖5）。

圖5 AV OMPAⅡ的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig．5 Secondary structure prediction of AV OMPAⅡ

2．3．5 AV OMPAⅡ的B細胞抗原表位預(yù)測 分別以Kyte－Doolittle氨基酸親水標(biāo)準(zhǔn)分析AV OMPAⅡ的親水區(qū)，Emini原則預(yù)測其表面可及性，Karplus－Sohulz的柔性蛋白預(yù)測方案預(yù)測其柔性區(qū)域，Jameson－Wolf分析其抗原指數(shù)。綜合以上各種方案預(yù)測結(jié)果，經(jīng)分析，雖然不同方案得到的能形成的B細胞抗原表位優(yōu)勢區(qū)的數(shù)量與區(qū)域有所不同，但綜 合 各 結(jié) 果：區(qū) 域 122－125、165－166、219－222、242－243、254－255、258－259、267－268、291－293、305－307、317－320，在此10個區(qū)域的預(yù)測參數(shù)值高于其他區(qū)域，因此，以上區(qū)域所形成B細胞抗原表位的可能性最大。

3 討 論

維氏氣單胞菌做為一種新型的人－獸－魚共患病原菌，近年來已引發(fā)多種水生動物不同疾病的爆發(fā)，其感染人的病例也時常報道，但國內(nèi)對其研究并不深入，有諸多問題尚待解決。外膜蛋白是革蘭氏陰性菌外膜的重要組成部分，在免疫原性和致病性方面起著至關(guān)重要的作用，其可以刺激機體產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫，起到保護機體免受病原菌攻擊的作用，相關(guān)研究表明：將AV的OMPs基因連接到真核表達載體，構(gòu)建DNA疫苗并免疫班帶副鱸，對AV的攻擊起到很好的保護作用［9］。鑒于此，本試驗針對AV OMPAⅡ基因設(shè)計一對特異性引物，對框鏡鯉源AV吉林分離株進行PCR擴增，得到目的基因片段，經(jīng)序列測定與分析：該菌株OMPAⅡ基因與GenBank的AV菌株AB290200和FJ711769 OMPAⅡ同源性為95%，與其他氣單胞菌同源性為83%左右，說明氣單胞菌屬間OMPAⅡ存在著一定的種屬差異。

通過信號肽預(yù)測，OMPAⅡ蛋白存在信號肽，序列為最前端23個N－末端氨基酸殘基，且為疏水性氨基酸。疏水區(qū)的存在不利于蛋白表達，所以在后續(xù)的異源表達試驗中，可將信號肽去掉，則有利于外膜蛋白的表達。經(jīng)預(yù)測OMPAⅡ無跨膜區(qū)，則預(yù)示該蛋白可能會較高量、可溶性的表達［10］。本試驗對AV OMPAⅡ基因編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)進行了預(yù)測，結(jié)果顯示：β折疊和β轉(zhuǎn)角占有較高的比例，而β轉(zhuǎn)角與無規(guī)則卷曲區(qū)域則可能形成抗原表位，本研究對B細胞抗原表位的預(yù)測綜合了多種參數(shù)，以提高預(yù)測的準(zhǔn)確性，最后得到10個區(qū)域可能是AV OMPAⅡB細胞抗原表位的位點。

本研究成功的克隆了AV OMPAⅡ基因，并對其編碼蛋白進行了分子特征、信號肽與跨膜區(qū)、二級結(jié)構(gòu)以及B細胞抗原表位的分析與預(yù)測，研究結(jié)果將為AV的基因工程疫苗、以及特異性免疫診斷奠定基礎(chǔ)。

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Cloning and bioinformatics analysis on outer membrane protein gene AⅡof Aeromonas veronii isolated from Jilin Province

SHAN Xiao－feng，WU Tong－lei，MENG Qing－feng，WANG Wei－li，QIAN Ai－dong

（College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

The purpose of this study was to clone outer membrane protein gene AⅡof Aeromonas veronii isolated from Jilin Province and analyze biological information of coding protein．Based on the sequence of published OMPAⅡgene，a pair of primers was designed to amplify the OMPAⅡgene by PCR technique，and was cloned into PMD18－T vectors．Then the positive recombinant plasmid was identified by PCR and sequencing．At last，the OMPAⅡgene homology among this strain and others was analyzed by Blast N，and the phylogenetic tree was constructed．Meanwhile，the related biological information of the coding protein was analyzed．The result showed that the OMPAⅡgene was 1001bp and the homology with others gene sequences reported by GenBank was 95%．By bioinformatics analysis，the OMPⅡprotein doesn’t contain transmembrane region and its N－terminal contains one signal peptide．The secondary structure mainly containsβ－pleated sheet andβ－turn，and ten regions are likely to contain B cell antigenic determinants．The OMPAⅡgene of Aeromonas Veronii was successfully cloned，and related biological information of the protein was analyzed．

Aeromonas Veronii；outer membrane protein gene AⅡ；gene cloning；sequence analysis；bioinformatics

R917．1

A

1002－2694（2011）12－1082－04

＊國家支撐計劃項目（2010BAD04B01）、吉林省科技廳項目（20080218）和吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)青年啟動基金項目聯(lián)合資助；單曉楓和吳同壘為同等貢獻

錢愛東，Email：qianaidong0115＠163．com

1．吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130118；2．吉林出入境檢驗檢疫局，長春 130062

2011－04－15；

2011－06－21