李曉光 于肖鵬 秦 艷 李騰宇 王旭霞 王延秀

(1.泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院，山東 泰安 271000； 2.泰安市第一人民醫(yī)院，山東 泰安 271000；3.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院口腔系，山東 青島 266071； 4.山東大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，山東 濟南 250012)

血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是血管生成過程中的關(guān)鍵因子，其過度表達(dá)與腫瘤生長、侵襲及轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[1]。研究[2]發(fā)現(xiàn)，催化一氧化氮(nitric oxide，NO)生成的關(guān)鍵酶——一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)活性的增高與腫瘤血管生成關(guān)系密切。本研究檢測了涎腺腺樣囊性癌VEGF、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的表達(dá)，以探討VEGF、iNOS和eNOS在涎腺腺樣囊性癌的表達(dá)及其相關(guān)性；研究NO和 VEGF的相互作用及在促腫瘤生長中的作用機制。

1 材料與方法

1.1臨床資料及切片制備 32例涎腺腺樣囊性癌組織均取自我院1984～2010年手術(shù)切除標(biāo)本蠟塊，患者年齡38～71歲，男11例，女21例。頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否以術(shù)后病理檢查結(jié)果為準(zhǔn)。所有病人術(shù)前均未接受化療或放療，根據(jù)TNM國際統(tǒng)一分期法(UICC)進(jìn)行臨床分期，Ⅰ+Ⅱ 期23例， Ⅲ+Ⅳ期9例。 組織學(xué)分型為管狀型6例，篩孔型15例，實體型11例。其中大涎腺17例(腮腺7例，頜下腺5例，舌下腺5例)，小涎腺15例。蠟塊制備5 μm厚連續(xù)切片，分別用抗VEGF單克隆抗體和 iNOS、eNOS多克隆抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，并做常規(guī)HE染色。

1.2免疫組織化學(xué)染色 第一抗體VEGF、iNOS、eNOS均為武漢博士德公司提供，3,3-二氨基苯聯(lián)胺(DAB)為Sigma公司產(chǎn)品，染色方法參照試劑盒說明按SABC法進(jìn)行。分別用1.5%正常兔血清和0.01 mol/L PBS液取代第一抗體作為替代對照和空白對照。用己證實 VEGF、iNOS、eNOS染色陽性的乳腺癌切片作陽性對照。

1.3VEGF、iNOS和eNOS的判斷標(biāo)準(zhǔn) 腫瘤細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，選擇每張切片組織和細(xì)胞形態(tài)保持完整的組織區(qū)域進(jìn)行免疫組化染色判斷。根據(jù)紀(jì)小龍等[3]提供的免疫組化陽性判斷標(biāo)準(zhǔn),結(jié)合全國免疫組化技術(shù)與診斷標(biāo)準(zhǔn)化專題研討會精神,按腫瘤細(xì)胞著色強度及陽性細(xì)胞比例,以10%以上細(xì)胞呈弱、中等強度陽性反應(yīng)為標(biāo)準(zhǔn),分為陽性及陰性。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理， VEGF、iNOS、eNOS蛋白表達(dá)間的關(guān)系用χ2檢驗。P≤0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1涎腺腺樣囊性癌VEGF、iNOS和eNOS的表達(dá) 32例涎腺腺樣囊性癌組織中，有20例(62.5%)表達(dá)VEGF， VEGF陽性物質(zhì)主要位于癌細(xì)胞的胞膜或胞漿(圖1)，而且腫瘤組織的周邊細(xì)胞染色要強于中心組織。變性壞死癌組織周邊VEGF染色較強。部分腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞及新生小血管內(nèi)皮也呈陽性。有22例(68.75%)表達(dá)iNOS，陽性顆粒主要見于癌細(xì)胞胞漿內(nèi)，為棕黃色,大多數(shù)為均勻著色,有的表現(xiàn)為小顆粒狀(圖2)。有25例(78.13%)表達(dá)eNOS，棕黃色癌細(xì)胞胞漿著色(圖3)。

圖1 VEGF陽性細(xì)胞漿內(nèi)含有棕色顆粒(×400)

圖2 iNOS陽性細(xì)胞漿內(nèi)含有棕色顆粒(×400)

圖3 eNOS陽性細(xì)胞漿內(nèi)含有棕色顆粒(×400)

2.2涎腺腺樣囊性癌VEGF、iNOS和eNOS表達(dá)的相關(guān)性 VEGF表達(dá)與iNOS表達(dá)具有明顯的相關(guān)性(P<0.05，表 1), VEGF表達(dá)與eNOS表達(dá)無明顯的相關(guān)性(P>0.05，表2)。

表1 涎腺腺樣囊性癌組織VEGF表達(dá)與iNOS表達(dá)的關(guān)系

表2 涎腺腺樣囊性癌組織VEGF表達(dá)與eNOS表達(dá)的關(guān)系

3 討 論

VEGF是血管生成的關(guān)鍵因子，其表達(dá)與腫瘤生長、侵襲及轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[1]。近年的研究[2]指出NO作為重要的血管擴張劑，可刺激VEGF產(chǎn)生并參與VEGF促血管生成過程中的每一步驟。本研究中32例涎腺腺樣囊性癌組織有20例(62.5%)表達(dá)VEGF，主要是癌細(xì)胞胞漿表達(dá)，VEGF表達(dá)具有明顯的異質(zhì)性，染色強度較高的腫瘤細(xì)胞多位于浸潤前緣。腫瘤間質(zhì)中也有散在分布的少數(shù)VEGF陽性的成纖維細(xì)胞。腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞也有部分表達(dá)VEGF，與癌巢較遠(yuǎn)的血管則無VEGF表達(dá)，說明腫瘤細(xì)胞分泌的 VEGF通過旁分泌方式作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞。

VEGF通過以下作用促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展：①直接刺激內(nèi)皮細(xì)胞分化增殖和遷移，加快基底膜降解，這不僅有利于血管生成，還有利于癌細(xì)胞脫落進(jìn)入血管或向鄰近纖維蛋白和結(jié)締組織基質(zhì)擴散，為腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。②增強血管通透性。③參與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，使腫瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。④誘發(fā)惡性腹水。⑤有研究[4]顯示 VEGF通過 VEGFR-2來維持內(nèi)皮細(xì)胞的存活，VEGFR-2的抗體可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

許多腫瘤組織中 NOS的表達(dá)增加，提示 NOS的異常表達(dá)以及NOS的生成可能與這些腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[5]。本研究中表達(dá)iNOS的涎腺腺樣囊性癌有22例(68.75﹪)，陽性顆粒主要見于癌細(xì)胞胞漿內(nèi)，腫瘤間質(zhì)中有部分巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞也呈陽性。表達(dá)eNOS的有25例(78.13%)。NO可在腫瘤早期通過介導(dǎo)DNA損傷來參與復(fù)雜的癌癥形成過程，還可通過刺激腫瘤細(xì)胞的侵襲性、誘導(dǎo)血管生成和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)來促進(jìn)腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[6]。有報道NOS活性的增高與腫瘤血管生成關(guān)系密切[2]，腫瘤血管生成與腫瘤組織局部NO濃度、腫瘤類型和腫瘤細(xì)胞對NO的敏感性有關(guān)。高NO產(chǎn)量的腫瘤細(xì)胞死亡，而產(chǎn)生少量NO或存在于低水平NO環(huán)境中的瘤細(xì)胞以及對NO殺傷作用不敏感的瘤細(xì)胞生存下來[6]。 Gallo等[7]對頭頸部腫瘤及以往對口腔癌[8-9]的研究結(jié)果亦提示NOS(eNOS和iNOS)的表達(dá)與腫瘤血管生成及腫瘤發(fā)展密切相關(guān)。

NO促血管生成的作用機制尚不清楚，但研究表明，NO主要在 VEGF調(diào)節(jié)的血管生成過程中發(fā)揮作用。有報道腫瘤細(xì)胞生成的 VEGF可增加內(nèi)皮細(xì)胞生成NO[10-11]，可增加內(nèi)皮細(xì)胞NOS的活性[12]。VEGF與內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體結(jié)合后，激活c-Src酪氨酸激酶，通過細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)蛋白及磷酸肌醇激酶途徑增強 NOS的表達(dá)，刺激產(chǎn)生 NO。NO又可增加VEGF的合成[13-14]。有研究[15]認(rèn)為 NO通過增強VEGF基因啟動子的活性來增加VEGF表達(dá)。另有報道認(rèn)為NO在VEGF促血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移中起重要作用[16-17]，而且NO還參與VEGF的促血管通透性的作用[18]。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示iNOS的表達(dá)與VEGF的表達(dá)有關(guān)。體外實驗表明，iNOS具有致突變性及誘發(fā)癌變的活性；體內(nèi)實驗亦表明由NO生成的亞硝胺對口腔腸道腫瘤的形成起一定作用。另有研究顯示iNOS調(diào)節(jié)抗VEGF活性的血管生成抑制因子的表達(dá)，提示有必要對NOS和VEGF的相互作用機制進(jìn)一步研究，探討NO在VEGF促血管生成過程中所起的作用，從而提供更多有關(guān)腫瘤血管生成的生物學(xué)信息。

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