李燾，屈新運(yùn)，王喆之

(陜西師范大學(xué)藥用資源與天然藥物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西北瀕危藥材資源開(kāi)發(fā)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，陜西西安710062)

植物多酚是一類(lèi)廣泛存在于植物體內(nèi)的酚類(lèi)化合物，主要存在于植物的皮、根、莖、葉及果中，在自然界中的儲(chǔ)量十分豐富［1］。大量的研究結(jié)果表明，植物多酚具有清除自由基、抗脂質(zhì)氧化、延緩衰老、預(yù)防心血管疾病、防癌、抗輻射等多種生物活性，人體攝入一定量的植物多酚可以有效地預(yù)防和控制某些疾病的發(fā)生［2－3］。菘藍(lán)Isatis indigotica Fort.為十字花科Cruciferae菘藍(lán)屬I(mǎi)satis的二年生草本植物，全國(guó)各地廣泛栽種;其根、葉均供藥用，分別稱(chēng)為板藍(lán)根和大青葉［4］。目前，對(duì)于板藍(lán)根、大青葉的植物化學(xué)及抗病毒、抗內(nèi)毒素、抗菌等生物活性方面的研究工作開(kāi)展的較多［5］，而對(duì)于菘藍(lán)種子的植物化學(xué)特性及相關(guān)活性的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)菘藍(lán)種子中總多酚超聲提取的條件進(jìn)行了優(yōu)化，并以DPPH法評(píng)價(jià)其抗氧化活性，為揭示菘藍(lán)種子的藥用價(jià)值和菘藍(lán)藥材資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

實(shí)驗(yàn)材料:購(gòu)自陜西地道中藥材種植有限公司。經(jīng)“藥用資源與天然藥物化學(xué)”教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室王炳利教授鑒定為十字花科Cruciferae菘藍(lán)屬I(mǎi)satis植物菘藍(lán)Isatis indigotica Fort.的干燥種子。沒(méi)食子酸(純度≥98%)、福林酚、DPPH等購(gòu)自Sigma公司，甲醇、石油醚、無(wú)水碳酸鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

實(shí)驗(yàn)儀器:FW－400A高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(北京科偉公司);UNICAM－UV300型分光光度計(jì)(美國(guó)熱電公司);HH－1B型數(shù)顯恒溫水浴鍋(國(guó)華電器有限公司);Q－BKYY31－2000型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);BT1245型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司);SHB－III循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);MILLIPORE超純水儀(密理博中國(guó)有限公司);索氏提取裝置;KQ－600DB型超聲清洗器(40.0 kHz，600W，昆山市超聲儀器有限公司)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菘藍(lán)種子的脫脂預(yù)處理將充分干燥的菘藍(lán)種子粉碎，過(guò)40目篩，取適量置于索氏提取器中，以石油醚為溶劑，80℃熱回流處理8 h。脫脂后的種子粉末烘干至恒重，備用。

1.2.2 單因素試驗(yàn)分別選取料液比、甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間等四個(gè)因素，以總多酚含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察不同因素對(duì)總多酚含量的影響，并確定各因素的適宜水平。各因素在不同水平變化時(shí)，均以料液比1∶15，甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%，提取溫度40℃和提取時(shí)間30 min為固定條件。單因素試驗(yàn)水平設(shè)置詳見(jiàn)表1。

表1 單因素試驗(yàn)因素水平Tab.1 Factors and levels in the one-factor experiment

1.2.3 L9(34)正交試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，每個(gè)因素分別選取三個(gè)水平，設(shè)置四因素三水平L9(34)正交試驗(yàn)，同樣以總多酚含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察各因素在總多酚提取過(guò)程中的交互作用，確定最佳提取工藝。正交試驗(yàn)各因素水平設(shè)置詳見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)因素水平Tab.2 Factors and levels in the orthogonal test

1.2.4 提取方法分別準(zhǔn)確稱(chēng)取5.00 g脫脂種子粉末，依照單因素和正交試驗(yàn)設(shè)置的不同條件進(jìn)行總多酚的超聲提取，過(guò)濾，真空濃縮，得總多酚提取物，并以相應(yīng)濃度甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量;分別精密吸取1 mL置于25 mL量瓶中，同質(zhì)量分?jǐn)?shù)甲醇稀釋至刻度，作為供試溶液。

1.2.5 總多酚含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)［6－7］描述的Folin－Ceocalteu法測(cè)定總多酚，結(jié)果以每克提取物中含有相當(dāng)于沒(méi)食子酸的毫克數(shù)表示。精密稱(chēng)取沒(méi)食子酸對(duì)照品10.15 mg，加甲醇溶解并定容至5 mL，得質(zhì)量濃度為2.03 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL置于5 mL棕色量瓶中，補(bǔ)足體積。從上述各量瓶中分別吸取0.5 mL不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液，依次加入2.5 mL Folin－Ceocalteu試液和2.0 mL 75 g/L Na2CO3溶液，總反應(yīng)體系為5 mL。將此混合液于50℃水浴5 min，在760 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。以吸光值對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸分析，得到?jīng)]食子酸質(zhì)量濃度(X，mg/mL)與吸光值Y之間的回歸方程為:Y=1.893 305X－0.119 67，相關(guān)系數(shù)r=0.999 3。沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度在0.04～0.15 mg/mL之間與吸光值具有良好的線性關(guān)系。同法測(cè)定各樣品的吸光值，依照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)質(zhì)量濃度，并依照下式計(jì)算樣品中總多酚的含量(W，mg/g):

總多酚W=(C·V·n)/m

式中，W為總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg/g);C為菘藍(lán)種子中總多酚質(zhì)量濃度(mg/mL);V為體積(mL)，n為稀釋倍數(shù);m為菘藍(lán)種子粉末質(zhì)量(g)。

1.2.6 DPPH法測(cè)總多酚的抗氧化活性采用DPPH法評(píng)價(jià)菘藍(lán)種子總多酚的抗氧化活性。參照文獻(xiàn)［8，9］的方法，配制濃度為1×10－4mol/L的DPPH·甲醇溶液。取最優(yōu)工藝條件提取的總多酚提取液2.0 mL，加入2.0 mL DPPH·甲醇溶液，搖勻，室溫靜置30 min，以提取溶劑調(diào)零，517 nm處測(cè)定吸光值，記為As;同法取2.0 mL提取溶劑，加入2.0 mL DPPH·甲醇溶液，混勻，待反應(yīng)穩(wěn)定后，測(cè)吸光值，記為A0;取2.0 mL總多酚提取液，加入2.0 mL提取溶劑，混勻，待反應(yīng)穩(wěn)定后，測(cè)吸光值，記為Ar。每個(gè)濃度平行測(cè)3次，取平均值。以BHT作陽(yáng)性對(duì)照，依照上述方法測(cè)定，并按照下式計(jì)算菘藍(lán)種子總多酚和BHT對(duì)DPPH·的清除率(Y，%):

Y(%)=(1－(As－Ar)/A0)×100%

式中，As表示樣品與DPPH·作用后的吸光值;Ar表示樣品自身的吸光值;A0表示DPPH·的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件對(duì)菘藍(lán)種子總多酚提取效率的影響

2.1.1 料液比對(duì)總多酚提取效率的影響不同料液比對(duì)總多酚的提取效率存在一定的影響。由圖1可以看出，料液比在1∶10到1∶25之間，隨著料液比的增加，總多酚的提取效率不斷增大;而當(dāng)料液比超過(guò)1∶25以后，總多酚含量的增加趨于平緩，并略有下降。在超聲提取過(guò)程中使用的溶劑量越大，所產(chǎn)生的傳質(zhì)動(dòng)力也越大，從而能夠更大效率地使多酚類(lèi)化合物充分溶解在提取溶劑中。然而，由于溶劑量的增大，在產(chǎn)生相同熱量的前提下，提取溫度相對(duì)較低，從而使得提取效率由于固液兩相存在的吸附平衡而降低［10］。不同料液比對(duì)總多酚提取效率的影響作用表現(xiàn)為隨著料液比的增加，提取效率在一定范圍內(nèi)不斷增大;而當(dāng)提取效率增大到一定水平時(shí)，增加料液比將不再提高提取效率。因此，綜合考慮經(jīng)濟(jì)因素和實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將正交試驗(yàn)中的料液比確定為1∶10、1∶20和1∶30三個(gè)水平。

圖1 料液比對(duì)總多酚提取率的影響Fig.1 The effects of solid-liquid ratio on the contents of total polyphones

2.1.2 甲醇濃度對(duì)總多酚提取效率的影響提取溶劑濃度不同，總多酚的提取效率也存在差異。從圖2可以看出，隨著甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)也隨之升高。當(dāng)甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，提取的總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.76 mg/g，而當(dāng)甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)上升至80%時(shí)，總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到5.89 mg/g。但當(dāng)甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于80%以后，總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)開(kāi)始出現(xiàn)明顯下降的趨勢(shì)，至甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90%時(shí)，總多酚降至4.24 mg/g。綜合考慮，正交試驗(yàn)的甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平確定為40%、60%和80%。

圖2 甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)總多酚提取率的影響Fig.2 The effects of methanol concentration on the contents of total polyphones

2.1.3 提取溫度對(duì)總多酚提取效率的影響不同溫度對(duì)總多酚提取效率的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3可以看出，溫度在30～70℃之間，隨著提取溫度的升高，總多酚從2.66 mg/g升高到7.39 mg/g，呈現(xiàn)不斷升高的趨勢(shì)。而當(dāng)溫度高于80℃以后，總多酚提取效率明顯下降，最低下降至5.21 mg/g。隨著溫度的升高，總多酚在甲醇中的溶解度也隨之升高;但當(dāng)溫度升高至一定水平，甲醇開(kāi)始逐漸揮發(fā)，總多酚在甲醇中的溶解受到一定的影響，總多酚量開(kāi)始下降。因此，綜合考慮溫度對(duì)總多酚提取效率的影響，正交試驗(yàn)的提取溫度水平確定為50、60和70℃。

圖3 提取溫度對(duì)總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.3 The effects of extraction temperature on the contents of total polyphones

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)總多酚提取效率的影響從圖4可以看出，提取時(shí)間不同，總多酚的提取效率不盡相同。隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，總多酚的量不斷升高，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到50 min時(shí)，總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高達(dá)到7.39 mg/g;而當(dāng)提取時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)，總多酚含量開(kāi)始下降，60 min時(shí)，總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.21 mg/g，較最高值下降了18.8%。此外，提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，酚類(lèi)物質(zhì)容易被氧化，不利于總多酚的提取，因此，綜合考慮提取時(shí)間對(duì)總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響，正交試驗(yàn)的提取時(shí)間確定為20、40和60 min 3個(gè)水平。

圖4 提取時(shí)間對(duì)總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.4 The effects of extraction time on the contents of total polyphones

2.2 菘藍(lán)種子總多酚提取的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別確定了影響總多酚提取效率各因素的合理水平，擬定四因素三水平的L9(34)正交設(shè)計(jì)方案進(jìn)行菘藍(lán)種子總多酚的提取。以總多酚含量為考察指標(biāo)，分析各因素的交互作用，確定最佳工藝參數(shù)，正交試驗(yàn)以及方差分析結(jié)果詳見(jiàn)表3和表4。

從表的極差分析可知，菘藍(lán)種子總多酚提取過(guò)程中各因素的最佳組合水平為:A1B2C1D2，即料液比1∶10，甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%，提取溫度50℃，提取時(shí)間40 min。各因素對(duì)總多酚提取效率的影響作用大小依次為:B＞C＞D＞A。

通過(guò)直觀分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)菘藍(lán)種子總多酚提取率影響最小的因素是料液比，故以料液比為誤差進(jìn)行方差分析，所得結(jié)果見(jiàn)表4。從表4可以看出，對(duì)菘藍(lán)種子總多酚提取率具有較顯著影響的因素是甲醇濃度(P＜0.05)。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析(n=3)Tab.3 Results and analysis for orthogonal experiment

表4 方差分析Tab.4 Variance analysis

在上述最佳提取工藝條件下，進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，菘藍(lán)種子總多酚得率如表5所示，其平均為(8.92±0.03)mg/g。因此，經(jīng)過(guò)正交試驗(yàn)篩選得到的最佳提取工藝條件具有可操作性，且重復(fù)性好，適用于菘藍(lán)種子總多酚的提取。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Results of validation experiment

2.3 菘藍(lán)種子總多酚的抗氧化活性評(píng)價(jià)用于樣品抗氧化活性評(píng)價(jià)的方法很多［11－12］，而DPPH·清除實(shí)驗(yàn)以其操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短等特點(diǎn)而成為當(dāng)前廣泛應(yīng)用的方法之一。本實(shí)驗(yàn)以菘藍(lán)種子總多酚提取物清除DPPH·的能力作為抗氧化活性評(píng)價(jià)指標(biāo)，并以BHT為陽(yáng)性對(duì)照，考察不同質(zhì)量濃度總多酚提取物(0.003～1.000 μg/mL)對(duì)DPPH·的清除活性，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6。從表6可以看出，菘藍(lán)種子總多酚提取物對(duì)DPPH·具有一定的清除能力，且清除能力與質(zhì)量濃度之間存在一定的量效關(guān)系;隨著

表6 菘藍(lán)種子總多酚提取物與BHT對(duì)DPPH·清除作用的比較(n=3)Tab.6 Comparisons on capacity of DPPH·scavenging between total polyphones extracts and BHT

總多酚質(zhì)量濃度的不斷升高，其對(duì)DPPH·的清除能力也不斷增大;當(dāng)總多酚提取物的質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH·的清除率可以達(dá)到92.00%，與BHT的清除效率基本相當(dāng)。因此，菘藍(lán)種子總多酚提取物具有一定的抗氧化活性，可以作為天然的抗氧化劑予以適當(dāng)?shù)拈_(kāi)發(fā)利用。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用超聲提取技術(shù)制備菘藍(lán)種子總多酚，同時(shí)考察料液比、甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、提取溫度以及提取時(shí)間等四個(gè)因素對(duì)總多酚提取效率的影響，并最終確定其最佳提取工藝條件為:料液比1∶10，甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%，提取溫度50℃，提取時(shí)間40 min。在此工藝條件下，菘藍(lán)種子總多酚得率為(8.92±0.03)mg/g?？寡趸钚栽u(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菘藍(lán)種子總多酚具有一定的清除DPPH·能力，且當(dāng)總多酚質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL時(shí)，其清除活性與人工抗氧化劑BHT基本相當(dāng)，具有作為天然抗氧化劑開(kāi)發(fā)利用的潛力。本研究工作為進(jìn)一步揭示菘藍(lán)種子的化學(xué)成分及生物學(xué)活性奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為菘藍(lán)藥材資源的合理開(kāi)發(fā)利用提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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