袁艷鵬 關(guān)云謙 林慶玲 薛金花 蔡彥寧＊

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)生物學(xué)研究室,北京 100053;2.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院細胞治療室,教育部神經(jīng)變性病重點實驗室,北京 100053)

晝夜節(jié)律的產(chǎn)生依賴于時鐘基因間在“轉(zhuǎn)錄-翻譯-翻譯后加工”水平相互作用而形成的負反饋環(huán)路。其核心涉及 bmal1,clock,npas2,cry1,cry2,per1,per2,per3等多個時鐘基因[1-3]。clock(或 npas2)和 bmal1翻譯后產(chǎn)物能夠形成 clock/bmal1異源二聚體,結(jié)合于時鐘基因 per(per1、per2和 per3)和 cry(cry1和 cry2)的啟動子區(qū),激活其轉(zhuǎn)錄,為正向調(diào)節(jié)因子;轉(zhuǎn)錄后的 per1、per2和 cry1、cry2在細胞質(zhì)中得到翻譯,繼而形成 per/cry復(fù)合體轉(zhuǎn)位返回細胞核,通過直接相互作用,干擾 clock/ bmal1異源二聚體的轉(zhuǎn)錄活性,充當(dāng)反向調(diào)控因子從而抑制 per和 cry自身的轉(zhuǎn)錄,由此形成負反饋調(diào)節(jié)環(huán)路[4-5]。由此,時鐘基因間構(gòu)成環(huán)路,產(chǎn)生并維持了表達、生理以及行為學(xué)水平的晝夜波動。

時鐘基因廣泛表達于多種組織、器官,甚至永生化細胞系中。其表達豐度常呈晝夜波動。但時鐘基因是否表達于每個細胞中?不同細胞中波動時相是否相同?這些問題仍有待回答。為此,本研究建立了一種基于反轉(zhuǎn)錄巢式多重 PCR的、高度靈敏的、能夠在單細胞水平檢測多種時鐘基因表達的體系,成功檢測到單細胞水平時鐘基因的表達情況。

1 材料和方法

1.1 材料

主要試劑：SuperScript.Ⅲ First-Strand Synthesis System for RT-PCR RNA抽提試劑 TR Izol,0.25%胰蛋白酶 (美國 invitrogen公司);Qiagen○RMultiplex PCR Kit(德國 Qiagen公司);PCR MasterMix,Riboprobe○Rin vitro Transcription Systems(美國 Promega公司); Transcript RNA clean up kit,SYBR Green Master Mix (日本 TaKaRa公司);DMEM(Dulbecco’s modified eagle’smedium,high glucose);胎牛血清 FBS;內(nèi)外側(cè)引物(引物序列見表 1)及 T7正向引物 (上海生物工程公司合成)。

儀器和耗材：PTC-100PCR儀,實時定量 PCR儀(美國MJ research公司);MM-33手動顯微操縱器 (美國WPI公司);紫外分光光度計(美國 GE公司);細胞培養(yǎng)皿(美國 Corning公司);玻璃電極 (中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供)。

1.2 方法

1.2.1 N I H/3T3細胞培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)的具體方案詳見文獻[6]：以1×106個N I H/3T3細胞接種在直徑10 cm的普通培養(yǎng)皿中,加入8～10 mL含 10%FBS的DME M培養(yǎng)基,2 d換液 1次,直至細胞生長覆蓋培養(yǎng)皿的 90%～100%,用0.25%胰蛋白酶消化細胞,得到單細胞懸液。高濃度血清 50% FBS刺激鋪滿培養(yǎng)皿的細胞分別持續(xù) 24 h和 36 h[7]。

表1 時鐘基因及內(nèi)參基因引物序列、擴增長度Tab.1 Pr im er sequence and amplicon size of clock genes and housekeeping gene

1.2.2 N I H/3T3單細胞及群體細胞的獲取

胰酶消化后的單細胞懸液稀釋至 50～100個細胞/10 cm培養(yǎng)皿。在顯微鏡監(jiān)測下,使用手動顯微操縱器移動玻璃電極接近目的細胞,給予一定的負壓將懸浮的細胞吸進電極內(nèi),取下電極將尖端折斷進 0.2 mL PCR管內(nèi),電極吸入無細胞培養(yǎng)基作為陰性對照[8]。將高血清刺激后的細胞用 0.25%胰蛋白酶消化后收集到 15 mL離心管內(nèi)離心棄上清,得到約 5× 106群體細胞。

1.2.3 體外轉(zhuǎn)錄制備基因 RNA模板

以各基因質(zhì)粒為模板,使用外側(cè)反向引物與帶 T7的正向引物,擴增出帶 T7的各基因片段。按照使用說明書,應(yīng)用 Riboprobe○Rin vitro Transcription Systems制備相應(yīng) RNA模板,并使用 Transcript RNA clean up kit純化 RNA模板。

1.2.4 單細胞反轉(zhuǎn)錄

7種基因外側(cè)反向引物等濃度混合為 GSP引物(gene specific primer),每種基因引物濃度為 2μmol/ L。在含單細胞的 PCR管中,加入 GSP引物,dNTP (10 mmol/L)各 0.5μL,加水至 5μL,混勻。65℃孵育 5 min,按照操作手冊加入 superscriptⅢ反轉(zhuǎn)錄酶[9]及 RNAase out、10×緩沖液、MgCl2和 DTT進行反轉(zhuǎn)錄,得到 10μL cDNA產(chǎn)物。

1.2.5 群體細胞 RNA獲取及反轉(zhuǎn)錄

應(yīng)用 TR Izol對群體細胞進行 RNA抽提,檢測RNA完整性良好進行反轉(zhuǎn)錄,與單細胞反轉(zhuǎn)錄過程相同,不再贅述。

1.2.6 巢式多重 PCR體系擴增條件

巢式外側(cè)多重 PCR擴增：反應(yīng)體系25μL,7對基因外側(cè)引物等濃度混合,終濃度 0.1μmol/L,2×Qiagen○RMultiplex PCR MasterMix 12.5μL,預(yù)變性 95℃15 min,3步擴增法 94℃ 30 s,57℃ 3 min,72℃1 min,15個循環(huán)[10],循環(huán)后增加延伸 72℃10 min。

巢式內(nèi)側(cè)單重 PCR擴增：反應(yīng)體系 20μL,取外側(cè)擴增產(chǎn)物 1μL為模板,引物終濃度為 0.5μmol/L, 2×Promega PCRMasterMix 10μL,預(yù)變性 95℃10 s, 3步擴增法 95℃5 s,58℃12 s,72℃12 s,35個循環(huán)。群體水平巢式內(nèi)側(cè)單重 PCR擴增換用 SYBR GreenMasterMix,余試劑及步驟相同。

1.2.7 擴增產(chǎn)物檢測

單細胞水平結(jié)果應(yīng)用 2%瓊脂糖凝膠電泳及測序雙重檢測擴增條帶。群體水平應(yīng)用實時定量 PCR檢測體系Opticon monitorⅡ檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用 SPSS 11.5統(tǒng)計學(xué)軟件處理,不同組間表達差異比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 巢式 PCR外、內(nèi)側(cè)擴增產(chǎn)物凝膠電泳

使用小鼠肝臟 cDNA為模板,使用各基因內(nèi)、外側(cè)引物進行擴增。電泳顯示擴增出預(yù)期目的條帶(圖1),清晰、單一、無非特異條帶。擴增產(chǎn)物克隆入 pGMT載體,得到相關(guān)質(zhì)粒,測序證實序列正確無誤 (結(jié)果未示)。

圖1 特異性引物擴增出時鐘基因外、內(nèi)側(cè)單一條帶Fig.1 Single band of clock genes amplification w ith specific pr im ersA：gel electrophoresis of external PCR products;B：gel electrophoresis of internal PCR products;M：indicatesDNA marker; 1：actin;2：bmal1;3：clock;4：cry1;5：cry2;6：per1;7：per;0：negative control.

2.2 巢式多重 PCR檢測體系靈敏度檢測

使用紫外分光光度計定量各種質(zhì)粒?；旌舷♂屩了铦舛?用于靈敏度分析。對于每個基因,分別使用 10、5、1個拷貝質(zhì)粒為模板,進行 10個巢式 PCR擴增。如表 2,10或 5拷貝的各種基因均可得到100%檢測。1拷貝的 actin,bm al1,clock,per1,per2能夠得到 100%的檢測。1拷貝的 cry1檢出率為 80%, cry2檢出率為 90%。

表2 巢式多重 PCR檢測體系 DNA水平靈敏度Tab.2 DNA sensitivity of nested multiplex PCR

2.3 反轉(zhuǎn)錄巢式多重 PCR靈敏度檢測

在單個細胞中檢測基因表達,需要先將細胞中的mRNA反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。為了 能在評估靈敏度時將反轉(zhuǎn)錄也納入考量,為此我們體外合成了各基因的RNA模板,電泳顯示 RNA完整(結(jié)果未示)。使用紫外分光光度計定量各種 RNA濃度,混合稀釋至所需濃度。分別使用 20、10、4個拷貝 RNA為起始模板,進行反轉(zhuǎn)錄和巢式多重 PCR擴增。如表 3所示,4個RNA拷貝的 cry2其檢出率達到 80%,其他基因均達到100%。

表3 巢式多重 RT-PCR檢測體系RNA水平靈敏度Tab.3 RNA sensitivity of nested multiplex RT-PCR

2.4 N IH/3T3單細胞時鐘基因檢測結(jié)果

使用顯微操作器,分別取出 10個單個 N I H/3T3細胞。細胞獲取過程如圖 2所示。對 10個單細胞及隨機的單細胞混合進行反轉(zhuǎn)錄多重巢式擴增,結(jié)果見表 4,每個細胞中時鐘基因表達譜差異明顯。

圖2 顯微鏡下單個目的細胞的獲取Fig.2 Co llecting single cellw ith m icroscope(10×)A：Glass electrode approaching the target cell;B：Single cell disappeared from the medium;C：Single cell in the glass electrode;Arrow points to single cell(magnification 10×).

表4 10個單細胞中時鐘基因檢測結(jié)果Tab.4 10 single cell results of clock genes

2.5 per1和 per2基因在群體水平和單細胞水平的表達差異

為了分析群體水平和單細胞水平是否存在差異。本研究利用實時定量 PCR和巢式多重RT-PCR分別研究了N I H/3T3細胞在群體和單細胞水平,時鐘基因per1和 per2在其表達高峰和低谷的表達。群體水平per1和 per2的表達量設(shè)定為 100%,相應(yīng)低谷表達量分別為28.5%和 17.1%。高峰與低谷間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。在單細胞水平,per1表達高峰時陽性細胞率為 84.8%;表達低谷時陽性細胞率為 74.3%,差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P=0.128)。單細胞水平,per2表達高峰時陽性細胞率為 72.7%;表達低谷時陽性細胞率為 40.0%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。

3 討論

近年來,單細胞中基因表達的解析日益受到重視。同質(zhì)細胞群體中的不同單細胞個體,其功能、結(jié)局卻千差萬別,這種差異是由不同細胞個體中的基因表達決定的。盡管眾多時鐘基因在組織、器官、細胞群體中的表達得到了廣泛的關(guān)注和研究,但針對單個細胞的研究仍然缺乏。為此,本研究建立了一種基于巢式多重PCR的、高度靈敏的、能夠在單細胞水平檢測多種時鐘基因表達的體系。結(jié)果顯示,該體系能夠檢出單拷貝DNA的各種時鐘基因。為了將反轉(zhuǎn)錄的因素也納入考量,我們還體外合成了不同時鐘基因的 RNA模板。結(jié)果顯示該體系能夠檢出至少4拷貝RNA的各種時鐘基因。將此體系應(yīng)用于N I H/3T3細胞,成功地分析了單個細胞中時鐘基因的表達。該體系可以應(yīng)用于諸多領(lǐng)域,并回答相應(yīng)的生物學(xué)問題。如 Alvarez J D等[11]發(fā)現(xiàn),時鐘基因在睪丸和胸腺組織中的表達不發(fā)生晝夜波動。組織化學(xué)分析顯示 per1和 clock并不在同一細胞中共表達。因此認(rèn)為,非共表達的時鐘基因不能形成相互調(diào)控的網(wǎng)絡(luò),從而阻礙了表達的晝夜波動。最近,Yagita K等[12]和 Kowalska E等[13]分別發(fā)現(xiàn),胚胎干細胞中時鐘基因的表達也呈恒定狀態(tài),再次提出非共表達的時鐘基因不能形成相互調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)而阻礙了表達的晝夜波動的可能性。作為一種高度靈敏的檢測手段,本研究方法將能最終檢驗上述理論的正確與否。利用此體系,我們還初步比較了群體水平和單細胞水平 per1和 per2在不同時相的表達,結(jié)果顯示群體水平per2的晝夜波動伴隨著單細胞水平的陽性細胞的減少,而 per1則無此特點。提示兩者表達調(diào)控上的差異。

在所檢測的 10個 N IH/3T3細胞中,時鐘基因表達譜差異有統(tǒng)計學(xué)意義。提示不同細胞間節(jié)律的非同步化。這一結(jié)論尚有待檢測更多的單細胞加以驗證。bm al1和 clock能夠形成異源二聚體,是一對功能伙伴。per1和 per2、cry1和 cry2也分別構(gòu)成功能對。研究[14-16]表明,只有 per1和 per2或 cry1和 cry2同時敲除掉,小鼠才徹底喪失節(jié)律。但各個功能對中基因兩兩表達是否相似,一直沒有定論。通過檢測單個N IH/3T3細胞,我們發(fā)現(xiàn),功能對中兩基因表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

總之,本實驗建立了高靈敏度的巢式多重 PCR檢測體系并成功地用于單細胞中時鐘基因表達的檢測,揭示了單細胞水平時鐘基因環(huán)路的異質(zhì)性。

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