楊 坤， 賈 雷， 魏思思， 江鳳娟

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京100850;2.解放軍302醫(yī)院全軍中藥研究所北京100039)

乙肝病毒的慢性感染是臨床的常見病和多發(fā)?。?-2］，嚴(yán)重危害了世界人民的健康。全球有約3.5億的 HBV感染者，其中，我國的感染率高達(dá)10% ～20%。目前，臨床上使用干擾素和腺苷類似物治療乙肝病毒的慢性感染，但是依然無法從“根”上治療慢性乙肝。因此，尋找安全、有效的抗HBV藥物是當(dāng)前要務(wù)。

苷泰膠囊來源于我院多年使用的協(xié)定方，主要由葉下珠、甘草、苦參等組成，在臨床上用于治療慢性病毒感染性肝炎伴有肝郁脾虛及濕熱互結(jié)證，治療效果顯著。本實驗分別使用2.2.15細(xì)胞和感染鴨乙型肝炎病毒的北京鴨為模型對其抗乙肝病毒作用進(jìn)行檢測和評價，為苷泰膠囊進(jìn)一步的研究提供一定的實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗試劑 苷泰膠囊，由解放軍第302醫(yī)院提供(090915);拉米夫啶，由英國葛蘭素有限公司生產(chǎn)(09020018)。胎牛血清，由美國Hyclone Lab公司生產(chǎn);HB-sAg和HBeAg固相放射免疫測定盒，由北方免疫試劑研究所生產(chǎn);α-32P-dCTP，由北京福瑞生物科技公司生產(chǎn);Sephadex G-50，F(xiàn)icoll PVP，由瑞典Pharmacia公司生產(chǎn);魚精 DNA和牛血清白蛋白均由中科院生理研究所提供;0.45 μm硝酸纖維素膜，由Amersham公司生產(chǎn)。其它試劑均為分析純。

1.2 實驗動物 1日齡的北京鴨，80～100 g，北京藥植所動物飼養(yǎng)場。動物飼養(yǎng)條件:貳級標(biāo)準(zhǔn)，(軍醫(yī)動字第B98006號)。

1.3 鴨乙型肝炎病毒 強(qiáng)陽性血清由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供，均采自然感染的上海麻鴨，選用其中DHBV DNA強(qiáng)陽性者(+++)，-70℃保存。

1.4 2.2.15細(xì)胞 HBV DNA轉(zhuǎn)染人的肝癌克隆細(xì)胞，由中科院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所提供。

1.5 儀器 BS-224型生物化學(xué)分析測定儀，由北京生化儀器廠生產(chǎn)。

2 實驗方法

2.1 對體內(nèi)鴨乙型肝炎病毒的影響 將上海麻鴨的DHBV DNA強(qiáng)陽性血清按照0.3 mL/只的劑量經(jīng)腿脛靜脈內(nèi)注射入1日齡的北京鴨體內(nèi)，染毒7 d后取血，檢測提取血清中DHBV DNA的含量。雛鴨的血清經(jīng)檢測呈DHBV陽性后，將雛鴨隨機(jī)分為6組，即病毒對照(模型)組、拉米夫定(0.05 g/kg)和苷泰膠囊(1.15、2.3、4.6 g/kg)3個劑量組，每組6只。按照1.5 mL/只，灌胃給藥，每天2次;病毒對照組給予同體積的生理鹽水。連續(xù)給藥或生理鹽水10 d。分別在給藥后第5天(T5)、第10天(T10)及停藥后第3天(P3)經(jīng)鴨脛靜脈取血，并分離血清，按照試劑盒中說明書的方法，做血清的斑點(diǎn)雜交，測定OD值(濾光片為490 nm)，計算血清DHBV-DNA光密度。

2.2 對2.2.15細(xì)胞內(nèi)乙型肝炎病毒的抑制作用

2.2.1 對2.2.15細(xì)胞的毒性作用:取2.2.15細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，計數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度至10萬個/mL，接種96孔培養(yǎng)板，每孔1 mL，置CO2孵箱(37℃ 5%CO2)培養(yǎng)24 h。用培養(yǎng)基將苷泰膠囊配制成含原藥16 g/L的溶液，分別稀釋至 8、4、2、1、0.5、0.25 mg/mL，加入培養(yǎng)板，每個濃度 3個孔，以無藥細(xì)胞組為空白對照，每4天換同濃度藥液。以細(xì)胞病變?yōu)橛^察指標(biāo)，于8 d后在顯微鏡下觀察其病變情況。完全破壞為4;75%破壞為3;50%破壞為2;25%破壞為1;無病變則為0。計算平均細(xì)胞病變程度及抑制百分率。按照ReedMeuench法計算TC50，TC0。見表2。

2.2.2 對乙型肝炎病毒表面抗原、e抗原的抑制作用:同上法培養(yǎng)2.2.15細(xì)胞，接種24孔培養(yǎng)板。在無毒濃度下，將分別為 500、250、125、62.5 μg/mL 4 個稀釋度的藥液加入培養(yǎng)板，每個濃度3孔，每4天換同濃度藥液，在第8天時收集培養(yǎng)液，-20℃下冰凍保存。用γ計數(shù)儀測量每孔的cpm值，計算其抑制率。

2.2.3 對2.2.15細(xì)胞DNA抑制實驗:同上法吸除培養(yǎng)液收取細(xì)胞，加入裂解液裂解細(xì)胞，用等體積的苯酚∶三氯甲烷∶異戊醇抽提2次，加入無水乙醇沉淀核酸，抽干，重新溶于20 μL TE緩沖液作為樣品。取20 μL(DNA含量25 μg)，經(jīng)變性和中和，以20X SSC緩沖液于硝酸纖維素膜上稀釋至1∶8倍，干烤、預(yù)雜交、雜交、洗膜、放射自顯影。沖洗X光片，用gel-pro軟件測定其密度，計算其抑制率。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用齊性資料用單因素方差分析(ANOVA)和配對t檢驗，選擇P＜0.05為其統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 對體內(nèi)鴨乙型肝炎病毒的影響 病毒對照組雛鴨感染血清DHBV-DNA后全部呈陽性，實驗全過程中血清DHBV-DNA的水平無明顯變動(P＞0.05)。與自身給藥前比較，苷泰膠囊高、中、低劑量組鴨在給藥后第10天，停藥后第3天，均能顯著地降低DHBV-DNA的水平(P＜0.01);陽性藥在給藥后第5、10天可以顯著地降低血清中DHBV-DNA的水平(P＜0.01)，但停藥3 d時，血清中DHBV-DNA的水平恢復(fù)至給藥前，呈現(xiàn)“反跳現(xiàn)象”。實驗結(jié)果表明，苷泰膠囊高、中、低劑量均可以有效地抑制DHBV-DNA的水平升高，并且呈現(xiàn)劑量依賴性。見表1，圖1，圖2。

3.2 苷泰膠囊對2.2.15細(xì)胞內(nèi)乙型肝炎病毒的抑制作用

表1 苷泰膠囊在鴨體內(nèi)對乙型肝炎病毒DHBV-DNA的影響 (±s)

表1 苷泰膠囊在鴨體內(nèi)對乙型肝炎病毒DHBV-DNA的影響 (±s)

各組給藥后 (T5、T10、P3)OD值與同組給藥前(T0)OD值比較。*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別 劑量/(g/kg)bid，po 動物/只 DHBV-DNA 水平T0 T5 T10 P3病毒對照組 6 0.982±0.24 0.996±0.17 0.988±0.20 1.017±.30苷泰 1.15 6 0.835±0.13 0.856±0.15 0.769±0.23＊＊ 0.741±0.10＊＊2.3 6 0.934±0.18 0.748±0.25＊＊ 0.569±0.17＊＊ 0.689±0.09＊＊4.6 6 0.989±0.005 0.716±0.090＊＊ 0.478±0.25＊＊ 0.588±0.05＊＊拉米夫定 0.1 6 0.951±0.06 0.621±0.15＊＊ 0.424±0.07＊＊0.968±0.09

圖1 苷泰膠囊組與病毒對照組鴨血清DHBV-DNA水平抑制率比較

3.2.1 苷泰膠囊對2.2.15細(xì)胞的毒性作用 表2表明，苷泰膠囊對2.2.15細(xì)胞產(chǎn)生50%抑制作用質(zhì)量濃度為793.7 μg/mL，無毒性濃度為500 μg/mL，提示苷泰膠囊的藥效濃度應(yīng)選擇500 μg/mL以下。

3.2.2 苷泰膠囊對2.2.15細(xì)胞分泌HbsAg、HbeAg的抑制作用

圖2 鴨血清中DHBV-DNA斑點(diǎn)雜交放射自顯影照片

結(jié)果見表3，圖3。實驗結(jié)果:苷泰膠囊質(zhì)量濃度在500、250、125、62.5 μg/mL 時，對 2.2.15 細(xì)胞 HbsAg分泌的抑制率分別為16.80%、11.22%、8.94%、4.18%，與病毒對照組比較均有顯著差異(P ＜0.01)，IC50=1 158.92 μg/mL;苷泰膠囊質(zhì)量濃度在500、250、125、62.5 μg/mL 時，對 2.2.15 細(xì)胞HbeAg分泌的抑制率分別為26.07%、14.31%、11.16%、4.28%，與細(xì)胞比較均有顯著性差異(P＜0.01)，IC50=1 794.14 μg/mL。實驗結(jié)果提示，苷泰膠囊對2.2.15細(xì)胞HBsAg、HBeAg的分泌具有一定的抑制作用并呈劑量依賴性。

表2 苷泰膠囊對2.2.15細(xì)胞的毒性作用 (n=3)

表3 苷泰膠囊在2.2.15細(xì)胞中對HbsAg和HbeAg分泌的影響

圖3 苷泰膠囊對2.2.15細(xì)胞分泌HbsAg和HbeAg的抑制作用量-效關(guān)系圖

3.2.3 苷泰膠囊對2.2.15細(xì)胞HBV-DNA的抑制實驗

結(jié)果見表4，圖4。苷泰膠囊質(zhì)量濃度在500、250、125、62.5 μg/mL時，對細(xì)胞HBV-DNA的抑制率分別為21.67%、13.71%、2.08%、3.24%，IC50=701.27 μg/mL;拉米夫定藥物質(zhì)量濃度在 500、250、125、62.5 μg/mL 時，對細(xì)胞 HBVDNA的抑制率分別為34.33%、21.44%、15.74%、0.02%，IC50=1 096.27 μg/mL。實驗結(jié)果表明，苷泰膠囊對細(xì)胞HBV-DNA水平具有一定的抑制作用并呈劑量依賴性。

4 討論

2.2.15 細(xì)胞系最早是由美國MountSinai醫(yī)學(xué)中心以HBV-DNA轉(zhuǎn)染人類肝癌細(xì)胞株，可以長期穩(wěn)定地分泌HB-sAg和HBeAg，是目前篩選抗乙肝病毒藥物的常用細(xì)胞模型［3］。鴨感染DHBV DNA模型可以長期維持病毒血癥，建立方便，并且該病毒與人乙肝病毒同屬嗜肝DNA病毒，復(fù)制過程相似，是國家認(rèn)可的體內(nèi)評價藥物抗乙肝病毒效果的重要模型［4］。2.2.15細(xì)胞及鴨乙肝病毒感染模型是研究乙肝發(fā)病機(jī)制、病毒復(fù)制過程及篩選有效藥物的理想模型，故本研究選用此兩種模型對苷泰膠囊的抗乙肝病毒活性進(jìn)行定量評價。

表4 苷泰膠囊在2.2.15細(xì)胞中對HBV-DNA水平的抑制作用

圖4 苷泰膠囊對2.2.15細(xì)胞中HBV-DNA的抑制作用量-效關(guān)系圖

乙型肝炎病毒在肝細(xì)胞內(nèi)持續(xù)復(fù)制會引起宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答，造成細(xì)胞的免疫病理損害，是導(dǎo)致肝炎慢性化的病理學(xué)基礎(chǔ)。因此針對乙肝病毒的慢性感染的抗病毒治療，是阻斷慢性乙型肝炎發(fā)展的主要措施。慢性病毒性肝炎屬中醫(yī)“黃疸”、“癥積”和“虛損”等病癥范疇。中醫(yī)認(rèn)為，慢性病毒性肝炎的主要病機(jī)多為濕熱夾注，或見虛實互見及本虛標(biāo)實。治當(dāng)清肝解毒、健脾益氣。本方中葉下珠可以清熱，涼血，解毒，利濕，以祛濕、瘀、熱、毒之邪，其化學(xué)成分主要有木脂素類及生物堿類鞣質(zhì)等多種成分［5-6］，是目前臨床上應(yīng)用廣泛的抗肝炎病毒中草藥之一［7-8］?？鄥⑿院?，味苦，可清熱解毒，主要含有具有抗腫瘤、降低轉(zhuǎn)氨酶、抗乙肝病毒等作用的氧化苦參堿和苦參堿等生物堿成分。在臨床上廣泛用于病毒性肝炎的治療。人參莖葉總皂苷用于肝炎的治療，可起到扶正作用。甘草健脾益氣，固本扶正，以補(bǔ)其虛。綜合全方，共奏清肝解毒、健脾益氣之功。

實驗結(jié)果表明，苷泰膠囊可以較好地在體外及體內(nèi)抑制乙肝病毒的復(fù)制，并且，隨著給藥劑量和時間的增加，對乙肝病毒的抑制作用逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)一定的劑量和時間依賴性。停藥后，沒有出現(xiàn)由于病毒再復(fù)制而產(chǎn)生的“反跳”現(xiàn)象。至于其活性部位有待于進(jìn)一步研究。

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