楊利輝，石文建，趙喜慶，汪洪江

（華北煤炭醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 唐山 063000）

鴉膽子油乳注射液對(duì)SKMG-4膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用研究

楊利輝，石文建，趙喜慶，汪洪江

（華北煤炭醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 唐山 063000）

目的 本實(shí)驗(yàn)擬研究鴉膽子油乳注射液對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞SKMG-4細(xì)胞生長(zhǎng)抑制及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。方法 體外培養(yǎng)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞SKMG-4，利用MTT比色法檢測(cè)鴉膽子油乳注射液對(duì)于SKMG-4的增殖抑制影響；用流式細(xì)胞術(shù)（flowcytometry，F(xiàn)CM）分析藥物處理前后SKMG-4的細(xì)胞周期變化；實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)不同處理組中凋亡基因bcl-2的表達(dá)。結(jié)果 MTT顯示鴉膽子油乳注射液對(duì)SKMG-4細(xì)胞增殖抑制作用呈劑量依賴性，當(dāng)濃度為5 g/L時(shí)，對(duì)SKMG-4細(xì)胞增殖的抑制率達(dá)到（72.1±2.2）%（P＜0.05）；流式細(xì)胞儀分析顯示，用5 g/L鴉膽子油乳注射液培養(yǎng)48 h，細(xì)胞周期中G1期所占比例增高，S期占細(xì)胞周期的比例降低；實(shí)時(shí)熒光定量pcr結(jié)果顯示隨著鴉膽子油乳注射液的濃度增加凋亡基因bcl-2mRNA的表達(dá)逐漸減少。與對(duì)照組比較P＜0.01。結(jié)論中藥鴉膽子油乳注射液可顯著抑制SKMG-4膠質(zhì)瘤細(xì)胞細(xì)胞增殖及促進(jìn)其凋亡。

鴉膽子油乳注射液；人腦膠質(zhì)瘤；Bcl-2；凋亡

鴉膽子是苦木科植物鴉膽子的成熟果實(shí)的提取物，研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)癌細(xì)胞有較高親和力，單獨(dú)應(yīng)用可以抗癌，具有扶正固本作用；聯(lián)合放、化療有增效減毒的作用；提高機(jī)體免疫力；保護(hù)骨髓造血功能，提升外周血象；毒性小、副作用小，臨床應(yīng)用安全。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了鴉膽子油乳注射液對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制作用。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞SKMG-4株有中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院神經(jīng)外科惠贈(zèng)。

1.2 藥品及試劑

鴉膽子油乳注射液購(gòu)自沈陽(yáng)藥科大學(xué)制藥廠（每支10mL，含鴉膽子油乳1 g）DMEM（HighGlycose）液體培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司，胎牛血清，MTT、碘化丙啶（PI）、二甲亞砜均購(gòu)自Sigma公司，兔抗人Bcl-2、SABC法免疫組化試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自天根公司。

2 方法

2.1 MTT比色法檢測(cè)鴉膽子油乳注射液對(duì)細(xì)胞的增殖抑制

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用DMEM（含10%新生牛血清）細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/mL的細(xì)胞懸液，加入96孔圓底細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)，每孔0.1 mL，置于37℃、飽和濕度、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)12 h后,實(shí)驗(yàn)組加入0.1 mL鴉膽子油乳注射液使藥物終濃度分別為5 g/L、2.5 g/L、1.25 g/L、0.625 g/L，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組除未加鴉膽子油乳注射液外，其余條件完全一致。37℃飽和濕度、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h后，加入pH7.4 PBS配制的5 g/L MTT 20μL/孔，再置37℃、5%CO2條件下4 h。取出，吸取上清液。加入DMSO 0.2 mL/孔，混勻30 min后在酶聯(lián)檢測(cè)儀上570 nm波長(zhǎng)處測(cè)A570值，以A570間接反映存活細(xì)胞數(shù)量。據(jù)此可推測(cè)各濃度鴉膽子對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制率，抑制率=（A對(duì)照組-A用藥組）/A對(duì)照組×100%。

2.2 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期變化

分別收集不同藥物濃度處理組和對(duì)照組處理48 h的SKMG-4細(xì)胞，均勻打散，PBS清洗1次，用預(yù)冷的70%乙醇重懸，且在4℃過(guò)夜。PBS清洗2次，分別加入PI（400 mg/mL）和RNaseA（1 mg/mL）各50 μL。4℃靜止30 min，然后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行周期分析。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)不同處理組中凋亡基因bcl-2的表達(dá)

將調(diào)整至同一濃度的各組總RNA分別逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以β-actin為內(nèi)對(duì)照進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr，基因引物序列（表1）。首次循環(huán)先在95℃變性2 min，然后變性、退火、延伸分別為95℃ 20 s，58℃ 25 s，72℃ 30 s，共45個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。根據(jù)CT值計(jì)算出對(duì)照組基因和處理組基因的ΔCT，再用對(duì)照組ΔCT-處理組ΔCT得到ΔΔCT，最終根據(jù)2-（ΔΔCT）得出處理組樣本基因相對(duì)于對(duì)照組樣本基因的量。

表1 基因引物序列

3 結(jié)果

3.1 鴉膽子油乳注射液對(duì)SKMG-4細(xì)胞增殖抑制作用

鴉膽子油乳注射液對(duì)SKMG-4細(xì)胞的增殖抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性。當(dāng)濃度為5 g/L時(shí)對(duì)膠質(zhì)瘤的抑制率為（72.1±2.2）%，與對(duì)照組相比P＜0.05。隨著藥物濃度的降低對(duì)膠質(zhì)瘤的抑制率隨之降低，當(dāng)濃度為0.625 g/L時(shí)抑制率為（16.0±2.5）%，與對(duì)照組相比P＜0.05（表2）。

3.2 流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞周期的作用

隨著鴉膽子油乳注射液濃度的增加，細(xì)胞周期中G1期的比例逐漸增加，S期的比例逐漸減小，說(shuō)明鴉膽子油乳注射液對(duì)SKMG-4的抑制再G1期（表3）。

3.3 鴉膽子油乳注射液對(duì)SKMG-4細(xì)胞bcl-2基因表達(dá)的影響

表2 不同濃度的鴉膽子對(duì)SKMG-4細(xì)胞抑制情況（n=5，）

表2 不同濃度的鴉膽子對(duì)SKMG-4細(xì)胞抑制情況（n=5，）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05。

組別 濃度（g/L） A570 抑制率（%）對(duì)照組 0 0.65±0.02 0藥物組 5 0.24±0.01* 72.1±2.2*2.5 0.33±0.02* 56.4±3.4*1.25 0.46±0.02* 33.6±3.6*0.625 0.56±0.01* 16.0±2.5*

表3 不同濃度的鴉膽子對(duì)SKMG-4細(xì)胞周期分布的影響（n=5，）

表3 不同濃度的鴉膽子對(duì)SKMG-4細(xì)胞周期分布的影響（n=5，）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05；**P＞0.05。

組別 濃度（g/L） G1% S%對(duì)照組 0 57.8±0.3 29.4±0.3藥物組 5 71.3±0.5 * 11.7±0.3*2.5 67.5±1.1 * 17.3±0.3*1.25 63.4±0.2 * 21.6±0.2*0.625 59.2±0.2 ** 25.1±0.2**

隨著鴉膽子油乳注射液作用濃度的增加，SKMG-4細(xì)胞的bcl-2基因的mRNA表達(dá)明顯減少，與對(duì)照組相比P＜0.01（表4）。

表4 不同藥物濃度處理的SKMG-4細(xì)胞中bcl-2mRNA的表達(dá)（n=5，）

表4 不同藥物濃度處理的SKMG-4細(xì)胞中bcl-2mRNA的表達(dá)（n=5，）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.01。

組別 濃度（g/L） 2-ΔΔCT對(duì)照組 0 1藥物組 5 0.025±0.004*2.5 0.076±0.005*1.25 0.186±0.029*0.625 0.771±0.074*

4 討論

鴉膽子為苦木科植物的成熟果實(shí)，鴉膽子油乳以鴉膽子石油醚提取物為原料，以精制大豆磷脂為乳化劑制成的水包油乳劑。研究表明，鴉膽子油乳可促進(jìn)骨髓干細(xì)胞形成，與放療和／或化療聯(lián)合用有一定的防止白細(xì)胞和血小板降低的作用[1]。臨床上鴉膽子油乳已聯(lián)合化、放療已廣泛應(yīng)用于肺癌[2-3]、肝癌[4]、食管癌[5]、胰腺癌[6]等多種惡性腫瘤的治療。但對(duì)膠質(zhì)瘤的研究較少。

此實(shí)驗(yàn)通過(guò)MTT比色法、流式細(xì)胞法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR觀察鴉膽子油乳注射液對(duì)膠質(zhì)瘤SKMG-4細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。MTT結(jié)果表明隨著鴉膽子油乳注射液濃度的增加，對(duì)SKMG-4細(xì)胞增值抑制作用逐漸增強(qiáng)。當(dāng)藥物濃度為5 g/L時(shí)，對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞有明顯的抑制率為（72.1±2.2）%，與對(duì)照組比較P＜0.05，而濃度為0.625 g/L時(shí)藥物對(duì)膠質(zhì)瘤的抑制作用較弱為（16.0±2.5）%（P＜0.05）。說(shuō)明鴉膽子油乳注射液對(duì)膠質(zhì)瘤的抑制呈劑量依賴型。

正常細(xì)胞周期主要由G1、S、G2和M期組成。其中以G1～S期轉(zhuǎn)換和G2～M期轉(zhuǎn)換最為重要。而G2～M調(diào)定點(diǎn)被認(rèn)為是腫瘤治療敏感性的主要決定因素[7]。此實(shí)驗(yàn)研究表明，隨著鴉膽子油乳注射液的濃度增加，G1期占細(xì)胞周期的比例逐漸增加，S期占細(xì)胞周期的比例逐漸減低。G1期的增加說(shuō)明鴉膽子油乳注射液使膠質(zhì)瘤細(xì)胞停止在G1期。S期即DNA合成期，可反應(yīng)細(xì)胞的增殖情況。S期占細(xì)胞周期的比例高,則提示DNA合成活躍。一般而言，腫瘤細(xì)胞的S期比例較正常細(xì)胞要高，其增殖活性也較正常細(xì)胞高[8]。流式細(xì)胞分析顯示隨著藥物濃度的增加G1期逐漸增加，S期逐漸降低，與對(duì)照組相比，P＜0.05。推測(cè)鴉膽子油乳注射液可能在S期抑制DNA的合成，從而使腫瘤細(xì)胞停滯在G1期。

近年來(lái)，凋亡（apoptosis）在腫瘤發(fā)生中的作用日益受到重視。bcl一2蛋白作為一種抑制凋亡因素調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞凋亡，研究表明其異常增加可抑制其它促凋亡因素的作用[9]。Bcl-2基因處于凋亡調(diào)控的終末部分，通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，可使腫瘤細(xì)胞生存時(shí)間延長(zhǎng)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要的作用[10-13]。大量研究表明，Bcl-2表達(dá)情況與腦膠質(zhì)瘤的分級(jí)和預(yù)后有相關(guān)性，并且Bcl-2表達(dá)還牽涉到腫瘤對(duì)放、化療的敏感性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量分析顯示隨著鴉膽子油乳注射液的增加bcl-2mRNA的表達(dá)逐漸減少，當(dāng)濃度為10 mg/L時(shí)，bcl-2mRNA表達(dá)為0.025±0.004，與對(duì)照組比較P＜0.01，說(shuō)明鴉膽子油乳注射液可通過(guò)抑制bcl-2表達(dá)來(lái)促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。

此實(shí)驗(yàn)明確了鴉膽子油乳注射液對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞有明確的抑制生長(zhǎng)作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞生長(zhǎng)周期于G1期是其抗瘤的重要機(jī)制，抑制bcl-2基因的表達(dá)在一定程度上參與了這一過(guò)程。但此實(shí)驗(yàn)只是在體外環(huán)境下研究鴉膽子油乳注射液抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。由于體內(nèi)環(huán)境的特殊性，鴉膽子油乳注射液能否在體內(nèi)發(fā)揮作用將是我們進(jìn)一步研究的目標(biāo)。

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Brucea javanica oil emulsion injection to dare crow SKMG-4 glial cells research

YANG Li-hui,SHI Wen-Jian,ZHAO Xi-qing,WANG Hong-jiang
(People Hospital Affi liated Noth China Coal Medical College Hebei Tangshan,Hebei 063000,China)

Objective To explore the effect of brucea javanica oil emulsion on apoptosis and restrain the grow of human glioma SKMG-4.Methods cultured human SKMG-4 glioma cells.Using MTT colorimetric assay to measure the inhibitory effect on proliferation of brucea javanica oil emulsion for SKMG-4 golima.Using flow cytometry analysis of drug treatmeat before and after the cycle of SKMG-4 glioma cells.Using real-time quantitative PCR to measure the express of bcl-2 in different group.Results The result of MTT showed the restrain of brucea javanica oil emulsion for SKMG-4 glioma are dose-dependent.When the consistence is 5g/l,the proliferation rate is(72.1±2.2)% (P＜0.05).Flowcytometry analysis showed that,with 10g/L brucea javanica oil emulsion cultured 48h,cell cycle G1 phase proportion increased,S phase cell cycle reduction in the proportion accounted for.Real-time quantitative PCR show with the increasing of brucea javanica oil emulsion the express of bcl-2mRNA becoming lower and lower.Compared with contrast group P＜0.01.Conclusion The brucea javanica oil emulsion can remarkably restrain the multiplication of SKMG-4 glioma and promote the cell to apoptosis.

Brucea Javanica Oil Emulsion;Golima;Bcl-2;Apoptosis

R739.41

B

10.3969/j.issn.1674-070X.2011.04.008.022.03

2011－02－07

楊利輝（1984－），男，河北邢臺(tái)人，在讀碩士研究生，主要從事膠質(zhì)瘤的化療工作。

馬宏宇）