楊樹猛 ，岳耀敬 ，楊博輝 ，郭 健，孫曉萍 ，牛春娥 ，馮瑞林 ，郭婷婷

（1.中國農業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅 730050；2.甘肅省甘南州畜牧科學研究所，合作 747000）

祁連白藏羊完整地保留了高原型藏羊的各項生產性能和體貌特征，尤以品質優(yōu)良的“祁連大白毛”著稱于世。白藏羊肉質鮮美，風味獨特，具有良好的開發(fā)前景。截至2006年，祁連縣藏羊存欄99.28萬只，占海北州藏羊總數(shù)的43.3%。為了促進這一優(yōu)勢品種的發(fā)展，同時促進以大白毛為基礎的藏地毯業(yè)發(fā)展，在農業(yè)部及各級政府部門的大力支持下，成立了祁連白藏羊選育中心，以該中心核心群為基礎開展白藏羊毛色完全純白為選育目的的白藏羊選育工作［1］。但目前白藏羊的毛色選育工作主要以常規(guī)育種手段的品種育種為主。許多研究結果和眾多的實例已揭示綿羊的毛色是由多基因位點上的復等位基因控制的。迄今，經試驗證明或理論推測判定的綿羊毛色基因位點共有11個［2］，因此應用常規(guī)育種技術難以選擇。綿羊分子育種技術的快速發(fā)展為開展青海白藏羊毛色控制基因機制研究和毛色分子標記輔助選擇提供了良好契機。

哺乳動物的毛色是由毛發(fā)中色素的多少決定，色素有真黑色素（eumelanin）與褐黑色素（pheomelanin）兩種類型，兩者的相對數(shù)量與分布決定了哺乳動物表現(xiàn)出從白至黑多種顏色［2］。關于哺乳動物毛色的發(fā)生及機理歷來受到廣泛關注，在研究一種被毛黑白相間的豚鼠Agouti時發(fā)現(xiàn)一種基因與其毛色相關，后來這種基因就被稱為Agouti，隨后在多種動物中發(fā)現(xiàn)該基因，并且具有相似調節(jié)機制。Agouti是一種旁分泌的信號因子，即Agouti信號蛋白（agouti signaling protein，ASIP），由臨近于黑色素細胞的真皮乳頭細胞所分泌，作用于毛囊微環(huán)境，阻止α2黑色素細胞刺激激素（α2MSH）與其受體（melanocort 2 in receptor 1，MC1R）的結合，從而拮頏黑色素的產生［2］。Norris等應用不對稱競爭性PCR（asymmetric competitive PCR）研究表明，不同品種羊由于Agouti信號蛋白基因拷貝數(shù)的變異和錯義突變導致了不同的毛色［3］。藏羊被毛顏色豐富，有關其毛色發(fā)生機制的研究尚屬空白，Agouti基因是否為控制青海白藏羊毛色的主效基因也未見研究報道。

從分子水平確定Agouti基因的基因型有助于在育種實踐中快速準確地控制藏羊的被毛類型，但第一步必須檢測該基因拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNVs）。在最近的研究中，實時定量PCR、侵染檢測、焦磷酸測序、寡核普酸連接分析法、不對稱競爭性PCR等技術都被用來進行CNV檢測［3-5］。相對于其他方法復雜、不便于一般實驗室操作的缺點，不對稱競爭性PCR可以直接對產物進行定量，操作簡單、安全，自動化程度高，不易產生污染［3，5］。本研究擬選取Agouti基因為研究對象，以藏羊血液基因組為材料，擴增藏羊Agouti基因序列，采用不對稱競爭性PCR技術測定藏羊Agouti基因的拷貝重復數(shù)，有望能夠建立一種更加有效的檢測方法，開展不同毛色藏羊Agouti基因拷貝數(shù)目變異與毛色之間的關系研究，為進一步開展Agouti基因多態(tài)性與藏羊毛色的早期分子標記輔助選擇研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 16只不同毛色藏羊血樣均采自青海省祁連縣白藏羊選育中心，頸靜脈采血10 mL，EDTA抗凝，－20℃冷凍保存?zhèn)溆茫瑫r進行毛色拍照登記。

圖1 不同毛色藏羊

1.2 試劑與儀器 2×Taq PCR Master Mix、血液基因組DNA提取試劑盒，均購自天根生化科技（北京）有限公司；BigDye?Teminator V3.1 Cycle Sequencing Kit購于ABI公司，主要包括BigDye?Teminator V3.1 Cycle Sequencing RR-100和Big-Dye?Teminator V3.1 Cycle 10×Sequencing Buffer；Hi-Di Formamide（去離子甲酰胺）購于ABI公司；其他常規(guī)藥品均為國產分析純。石蠟油購自北京鼎國生物技術有限責任公司。ABI3130xl全自動測序儀為美國應用生物系統(tǒng)公司產品；VeritiTM 96-Well Thermal Cycler型PCR儀為美國 ABI公司產品；Allegra TM 21R離心機為美國Beckman公司產品；熒光定量PCR儀CFX96為美國Bio-Rad公司產品；Nano Drop ND-2000核酸定量儀為美國Nanodrop公司產品。引物合成及測序由上海生工生物技術開發(fā)有限公司完成。

1.3 引物的設計與合成 從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載綿羊Agouti基因全序列（GenBank accession No.EU216425），用Primer 5.0設計目的基因的不對稱競爭性PCR［3］。引物 序 列 （5'-3'） 分 別 為 ：Agt16：FamCAGCAATGAGGACGTGAGTTT；Agt17：GTTTCTGCTGGACCTCTTGTTC；Agt18：gtgCCTTGTGAGGTAGAGATGGTGTT。引物 Agt17和Agt16對用于擴增Agouti基因5'斷裂點（5'breakpoint）238 bp片段，引物 Agt18和 Agt16對用于擴增Agouti基因連接點（junction point）242 bp 片段，引物由上海生工生物工程公司合成。

圖2 Agouti基因引物Agt17、Agt18、Agt16擴增示意圖

1.4 不對稱競爭性PCR 不對稱競爭性PCR擴增體系：①Agouti基因：2×TaqMan Genotyping Master Mix 10 μL，Agt16 引物 Forward Primer（1 μM）0.5 μL，Agt17引物Reverse Primer（10 μM）1 μL，Agt 18 引物（10 μM）1.0 μL，模板 DNA 4 μL，雙蒸水 ddH2O 3.5 μL，總計 20 μL。為確保實驗的可靠性，所有參與實驗的樣品、對照均進行3次重復。

PCR 條件：95 ℃ 5min，95 ℃ 1min，60.0 ℃ 30s，72 ℃60 s，共50個循環(huán)；72℃延伸10 min。

按照ABI3130xl全自動測序儀說明書要求，制備測序樣品，并對PCR產物進行測序檢測Agouti基因拷貝數(shù)。依據(jù)檢測結果，Agouti基因拷貝數(shù)即Agouti基因連接點的比值為Agouti基因連接點（junction point）242 bp片段峰面積與Agouti基因連接點（junction point）242 bp片段峰面積加Agouti基因5'斷裂點（5'breakpoint）238 bp片段峰面積的比值=A242/（A242+A238）。

1.5 待測樣品Agouti基因拷貝數(shù)的標準曲線建立 依據(jù)Norris等（2008）建立Agouti基因拷貝數(shù)的標準曲線的方法建立藏羊Agouti基因拷貝數(shù)的標準曲線：①Agouti基因連接點標準品PCR產物制備：2×TaqMan Genotyping Master Mix 10 μL，Agt16 引物 Forward Primer（10 μM）1.0 μL，Agt17 引物 Reverse Primer（10 μM）1 μL，Agt18引物（10 μM）1.0 μL，模板 DNA 4 μL，雙蒸水 ddH2O 3.5 μL，總計 20 μL。②Agouti基因 5'斷裂點標準品 PCR產物制備：2×TaqMan Genotyping Master Mix 10 μL，Agt16引物 Forward Primer（10 μM）1.0 μL，Agt18 引物 Reverse Primer（10 μM）1 μL，Agt18 引物（10 μM）1.0 μL，模板DNA 4 μL，雙蒸水 ddH2O 3.5 μL，總計 20 μL。③將步驟①、②PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠回收238 bp、242 bp片段，將回收各樣品的兩個PCR片段用T4連接酶連接構建 pMD19－junction point、pMD19－5'break point載體，轉化大腸桿菌（Escherichia.coli）感受態(tài)細胞JM109。藍白斑篩選陽性克隆，小量抽提質粒后質粒測序鑒定。經測序鑒定后確認為pMD19－junction point、pMD19－5'break point載體作為Agouti基因拷貝數(shù)的標準曲線基因檢測的標準品。

用Nano Drop ND－2000核酸定量儀分別測定標準品pMD19－junction point、pMD19－5'break point載體的濃度，統(tǒng)一稀釋為 10 ng/μL，然后將 pMD19－5'break point/pMD19－junction point載體的濃度比分別稀釋為0、25%、35%、50%、65%、75%、100%后進行不對稱競爭性PCR擴增，檢測Agouti基因拷貝數(shù)即Agouti基因連接點的比值，繪制標準曲線。

1.6 待測樣品Agouti基因拷貝數(shù)的測定 根據(jù)50個未知樣品的原始DNA濃度，使用雙蒸水分別將其稀釋，使其濃度均達到10 ng/μL，配制成工作液待用。分別對50個未知樣品（體系內終濃度分別為10 ng/μL）的Agouti基因進行不對稱競爭性PCR擴增，依據(jù)標準曲線確定Agouti基因拷貝數(shù)。

2 結果與討論

2.1 藏羊基因組DNA 圖3為藏羊血樣中提取的基因組DNA，經充分溶解，適當稀釋后，以0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測所得的電泳圖譜。結果表明，所提取基因組DNA條帶清晰、明亮、無降解，質量較好。經紫外分光光度計檢測，所提取基因組DNA的OD260/OD280比值約為 1.80，濃度 200～300 ng/μL，說明 DNA 純度和濃度符合要求，可用于定量PCR實驗。

圖3 藏羊血樣中提取的基因組DNA

2.2 Agouti基因拷貝數(shù)的不對稱競爭性PCR 將不對稱競爭性PCR擴增產物，按照ABI3130xl全自動測序儀說明書要求，制備測序樣品，并對PCR產物進行測序檢測Agouti基因拷貝數(shù)。檢測結果用ABI3130xl全自動測序儀自帶軟件GeneMapper software－Microsatellite Analysis工作流程進行分析，共檢測出兩個峰（圖4），分別為引物Agt17和Agt16對用于擴增Agouti基因5'斷裂點（5'break point）238 bp片段峰，引物Agt18和Agt16對用于擴增Agouti基因連接點（junction point）242 bp片段峰。擴增產物測序結果與擴增的目的片段完全吻合，表明該方法具有很好的特異性。

圖4 ABI3130xl全自動測序儀檢測結果

2.3 Agouti基因拷貝數(shù)的標準曲線 以Agouti基因連接點的比值即A242/（A242+A238）為縱坐標，以pMD19－5'breakpoint/pMD19－junction point載體的濃度比為橫坐標繪制標準曲線（圖5）。由圖5可知，Agouti基因連接點的比值等于 pMD19－5'break point/pMD19－junction point載體的濃度（r2＝0.999）。結果表明：pMD19－5'break point/pMD19－junction point載體的濃度比在1%～100%范圍內均與所測得的相應峰面積比呈良好的線性關系，可以用該標準曲線對Agouti基因進行相對定量，檢測Agouti基因拷貝數(shù)。

圖5 標準品Agouti基因的標準曲線

2.4 未知樣品Agouti基因的定量檢測 對16只藏羊的基因拷貝數(shù)進行了不對稱競爭性PCR擴增產物，記錄所得Agouti基因連接點的比值。對樣品（n＝16）的Agouti基因連接點的比值進行分析，區(qū)分未知樣品Agouti基因的拷貝數(shù)（圖6）。當Agouti基因連接點的比值為0.33時，表明只有1個Agouti基因連接點，即只含有1個拷貝的ASIP黑色隱形基因位點，當Agouti基因連接點的比值為0.5時，表明有2個Agouti基因連接點，即含有3個拷貝的ASIP基因位點。結果顯示10只全白藏羊均為3～6個拷貝之間，其余不同毛色藏羊的拷貝數(shù)為2個拷貝。

圖6 未知樣品Agouti基因拷貝重復數(shù)的Agouti基因連接點的比值（n＝16）

3 結論

本研究建立了不對稱競爭性PCR檢測Agouti基因拷貝重復數(shù)變異的方法，該方法可以直接對產物進行定量，具有良好的穩(wěn)定性和特異性，而且操作簡單、安全，自動化程度高，不易產生污染，不需昂貴設備，適合在普通實驗室檢測。為開展Agouti基因多態(tài)性與藏羊毛色的早期分子標記輔助選擇研究奠定基礎。

［1］王永，鄭玉才，梁梓，等.草地藏系綿羊羊肉品質特性研究［J］.中國草食動物，2006，26（Z1），195－198.

［2］范瑞文，董常生，赫曉燕，等.哺乳動物毛色色素Agouti基因位點的研究進展［J］.動物醫(yī)學進展，2004，25（3）：59－61.

［3］Norris B J，Whan V A.A gene duplication affecting expression of the ovine ASIP gene is responsible for white and black sheep［J］.Genome Res，2008，18：1282－1293.

［4］Stranger B E，F(xiàn)orrest M S，Dunning M，et al.Relative impact of nucleotide and copy number variation on gene expression phenotypes［J］.Science，2007，315：848－853.

［5］Pielberg G，Day A E，Plastow G S，et al.A sensitive method for detecting variation in copy numbers of duplicated genes［J］.Genome Res，2003，13：2171－2177.