韓夢燃，陳文成，劉志忠，凌賽泳，黃艷新

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科，廣西 百色 533000；2. 北京市博愛醫(yī)院檢驗科，北京 100068；3. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒童保健康復(fù)科，廣西 百色 533000)

腦性癱瘓 (腦癱，cerebral palsy，CP)是一系列姿勢和運動障礙的非進行性綜合征，是兒童殘疾的常見原因之一[1]。腦癱的主要臨床特征是肌肉張力、運動和運動技能異常[2]。根據(jù)2015年中國腦性癱瘓康復(fù)指南，患病率約為每1000活產(chǎn)兒中有2.0‰～3.5‰[3]。兒童腦癱的主要發(fā)病原因有缺氧缺血性腦病、顱內(nèi)出血、高膽紅素血癥、感染、早產(chǎn)兒和宮內(nèi)感染[4]。目前已發(fā)現(xiàn)線粒體與多種腦部疾病的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系，每個細胞的線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)含量主要以拷貝數(shù)來衡量[5]2435。因此尋找腦癱與線粒體DNA 拷貝數(shù)之間的聯(lián)系是我們亟待解決的問題。本研究旨在分析線粒體DNA拷貝數(shù)在兒童腦性癱瘓中的表達，并進一步分析這項指標(biāo)與腦性癱瘓臨床特征的關(guān)系，從而為兒童腦性癱瘓的早期診斷和治療提供依據(jù)，提高兒童腦癱的早期診斷成功率。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2020年1月1日—2020年12月31日在右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒童保健康復(fù)科門診確診的50例腦性癱瘓兒童為腦癱病例組，其中男性31例，女性19例，年齡0～6歲，年齡M(P25～P75)為1.3(1.0～2.4)歲。腦癱臨床分型通常為痙攣型32例、運動障礙型14例和共濟失調(diào)型4例[6]；痙攣型腦癱進一步分為雙癱7例、四肢癱21例和偏癱4例，符合中國腦性癱瘓康復(fù)指南(2015)中的腦癱診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。同期選取本院健康體檢的100例兒童為健康對照組，其中男性64例，女性36例。年齡0～6歲，年齡M(P25～P75)為2.1(1.1～4.1)歲，兩組研究對象年齡、性別和民族差異無統(tǒng)計學(xué)意義。納入標(biāo)準(zhǔn)：①本實驗?zāi)X癱病例組的研究對象是診斷后未經(jīng)康復(fù)訓(xùn)練和治療的初治腦癱病例；②年齡在0～6歲，性別不限。排除標(biāo)準(zhǔn)：①佝僂??；②線粒體腦?。虎燮渌窠?jīng)相關(guān)疾病。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號：YYFY-LL-2021-15)，受試者監(jiān)護人均知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 儀器和試劑 線粒體DNA拷貝數(shù)檢測所需的Drop Maker樣本制備儀，Chip Reader 生物芯片分析儀均產(chǎn)自北京新羿生物有限公司，基因擴增儀產(chǎn)自杭州朗基科學(xué)儀器有限公司。DNA提取試劑盒均為Axygen生產(chǎn)的試劑。

1.3 方法

1.3.1 全血標(biāo)本的采集 采集研究對象外周靜脈血2 ml，置于 EDTA抗凝管中，于-80 ℃冰箱中進行儲存，待行DNA的提取。

1.3.2 DNA提取 使用Axygen DNA提取試劑盒進行DNA提取。使用紫外分光光度計分析DNA的濃度和純度，所有DNA樣品的OD260/OD280值為1.7～2.0。所有的DNA樣品在使用前都儲存在-80 ℃冰箱中。

1.3.3 線粒體DNA拷貝數(shù)檢測 用熒光FAM(5′-FAM/3′-TAMRA)和熒光VIC(5′-VIC/3′-TAMRA)標(biāo)記微液滴數(shù)字PCR系統(tǒng)的探針。線粒體DNA定量為線粒體基因(NADH脫氫酶1基因，ND1)與單拷貝核基因(人β珠蛋白基因，HBB)的比率。每個細胞的線粒體DNA拷貝數(shù)用公式2×ND1/HBB計算。所用的特異性引物和探針如下：ND1：F5′-ATTCGATGTTGAAGCCTGAGACT-3′/R5′-TGACCCTTGGCCATAATATGATT-3′，probe5′-FAM-TTCGGACTCCCCTTCGGCAAGG-TAMRA-3′；HBB：F5′-AAAGGTGCCCTTGAGGTTGTC-3′/R5′-TGAAGGCTCATGGCAAGAAA-3′，probe5′-VIC-CCZGGCCATCATAAAGGCACCGA-TAMRA-3′。

2 結(jié)果

2.1 受試者資料比較 兩組受試者的性別、年齡、民族資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組的一般情況比較

2.2 不同性別和民族腦癱病例組與健康對照組線粒體DNA拷貝數(shù)水平比較 腦癱病例組男性為(124.33±43.17)個/細胞，女性為(130.93±41.15)個/細胞，男性與女性線粒體DNA 拷貝數(shù)水平對比：t=-0.527，P=0.600；健康對照組男性為(84.57±27.44)個/細胞，女性為(79.09±19.80)個/細胞，男性與女性線粒體DNA 拷貝數(shù)水平對比：t=1.052，P=0.296。腦癱病例組和健康對照組男性線粒體DNA拷貝數(shù)水平對比：t=4.752，P<0.001；腦癱病例組和健康對照組女性線粒體DNA 拷貝數(shù)水平對比：t=-5.509，P<0.001。腦癱病例組壯族為(127.28±46.39)個/細胞，漢族為(136.07±33.86)個/細胞，其他少數(shù)民族為(104.91±27.64)個/細胞，腦癱病例組不同民族線粒體DNA 拷貝數(shù)水平對比：F=1.106，P=0.339；健康對照組壯族為(83.90±29.14)個/細胞，漢族為(83.09±18.39)個/細胞，其他少數(shù)民族為(73.86±22.76)個/細胞，健康對照組不同民族線粒體DNA 拷貝數(shù)水平對比：F=0.685，P=0.506；腦癱病例組和健康對照組壯族線粒體DNA 拷貝數(shù)水平對比：t=4.754，P<0.001；腦癱病例組和健康對照組漢族線粒體DNA 拷貝數(shù)水平對比：t=5.178，P<0.001；腦癱病例組和健康對照組其他少數(shù)民族線粒體DNA 拷貝數(shù)水平對比：t=-2.443，P<0.001。同一性別或同一民族腦癱病例組線粒體DNA拷貝數(shù)水平高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，腦癱病例組或健康對照組不同性別或不同民族間的線粒體DNA拷貝數(shù)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖1、圖2。

注：***P<0.001，ns：P>0.05。

注：***P<0.001。

2.3 不同年齡階段腦癱病例組與健康對照組線粒體DNA拷貝數(shù)水平比較 腦癱病例組～2歲、～4歲、～6歲分別為(131.55±44.34)個/細胞，(112.72±28.13)個/細胞，(120.73±50.38)個/細胞；腦癱病例組三個年齡階段的線粒體DNA 拷貝數(shù)水平對比：F=0.826，P=0.444；健康對照組～2歲、～4歲、～6歲分別為(94.78±25.26)個/細胞，(78.28±22.56)個/細胞，(70.66±19.86)個/細胞，健康對照組三個年齡階段的線粒體DNA 拷貝數(shù)水平對比：F=10.220，P<0.001；三個年齡段的腦癱病例組和健康對照組的線粒體DNA 拷貝數(shù)水平對比：t值分別為4.330、3.930、4.053，P值均<0.001。腦癱病例組的線粒體DNA 拷貝數(shù)水平隨著年齡的增長無變化，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；健康對照組的線粒體DNA 拷貝數(shù)水平隨著年齡的增長有變化，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。腦癱病例組與健康對照組相同年齡階段的線粒體DNA 拷貝數(shù)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

注：***P<0.001。

2.4 不同腦癱類型線粒體DNA拷貝數(shù)水平的比較痙攣型和非痙攣型腦癱線粒體DNA拷貝數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；痙攣型腦癱中的雙癱、四肢癱和偏癱的線粒體DNA拷貝數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 腦癱病例組線粒體DNA拷貝數(shù)與臨床特征的關(guān)系

2.5 線粒體DNA 拷貝數(shù)表達與腦性癱瘓發(fā)生的關(guān)聯(lián)性 以健康對照組中線粒體DNA拷貝數(shù)的平均數(shù)來衡量腦癱病例組線粒體DNA拷貝數(shù)高低，健康對照組線粒體DNA拷貝數(shù)的平均數(shù)是82.60，則線粒體DNA拷貝數(shù)的賦值為：<82.60=0，≥82.60=1。單因素Logistic回歸分析線粒體DNA拷貝數(shù)與腦性癱瘓的關(guān)聯(lián)性，OR及95%CI為10.127(3.952～25.948)，提示線粒體DNA拷貝數(shù)與腦性癱瘓的發(fā)生有關(guān)聯(lián)；多因素Logistic 回歸，校正了性別、年齡、民族等因素后，校正的OR及95%CI為11.520(4.271～31.070)，P<0.001，有統(tǒng)計學(xué)意義，表明高表達量線粒體DNA拷貝數(shù)與腦性癱瘓的發(fā)生有關(guān)聯(lián)，見表3。

表3 線粒體DNA 拷貝數(shù)與腦性癱瘓的單因素、多因素Logistic 回歸分析

2.6 診斷價值 ROC曲線評估線粒體DNA拷貝數(shù)水平對腦癱兒童的診斷價值 ROC曲線分析結(jié)果顯示，線粒體DNA拷貝數(shù)鑒別診斷腦癱兒童和正常兒童的ROC曲線下面積(AUC)為0.834(95%CI：0.770～0.913)。根據(jù)ROC曲線計算Cut-off值，得出線粒體DNA拷貝數(shù)的最佳診斷截斷值為94.620個/細胞。根據(jù)此截斷值計算鑒別診斷腦癱兒童和正常兒童的靈敏度、特異度分別為79.00%、78.00%，見圖4。

圖4 線粒體DNA拷貝數(shù)水平診斷腦癱的ROC曲線

3 討論

腦癱是由發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)不同區(qū)域的各種損傷引起的，具有永久性的、非進展性的特點[7]，在大多數(shù)腦性癱瘓病例中，腦損傷發(fā)生在早期胎兒腦發(fā)育過程中，腦出血和腦室周圍白質(zhì)軟化是腦性癱瘓早產(chǎn)兒的主要病理表現(xiàn)[8]。線粒體是機體能量的制造中心，廣泛分布于真核細胞中[9]。除了產(chǎn)生能量以外它還介導(dǎo)細胞過程，如凋亡和增殖[10-11]，并參與神經(jīng)元功能，如突觸可塑性[12]。線粒體功能的實現(xiàn)依賴于線粒體DNA基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄，而線粒體DNA 拷貝數(shù)變化受環(huán)境、遺傳等因素影響，其中氧化應(yīng)激作用是重要因素之一，線粒體內(nèi)線粒體DNA拷貝數(shù)變化必然引起線粒體功能改變，因此線粒體DNA 拷貝數(shù)是線粒體功能的生物標(biāo)記物[13]。但是關(guān)于線粒體DNA 拷貝數(shù)和兒童腦癱相關(guān)的研究鮮有報道。

本研究通過ddPCR技術(shù)絕對量化線粒體DNA 拷貝數(shù)，從而發(fā)現(xiàn)腦癱兒童線粒體DNA 拷貝數(shù)顯著高于健康兒童。本結(jié)論與Lu B等[14]的研究結(jié)論不一致，分析可能是線粒體功能受損后的代償性復(fù)制所導(dǎo)致的[15]，因為我們的研究對象未經(jīng)康復(fù)訓(xùn)練和治療，最大程度上體現(xiàn)機體對于腦部損傷的反應(yīng)。無論是從性別、年齡或民族進行統(tǒng)計學(xué)分析，腦癱兒童線粒體DNA 拷貝數(shù)高于健康兒童。但同一組內(nèi)不同性別或不同民族線粒體DNA 拷貝數(shù)比較，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。這就說明線粒體DNA 拷貝數(shù)變化是由于病理原因?qū)е碌模c性別和民族無關(guān)。本研究中我們將0～6歲分為三個年齡階段：～2歲、～4歲、～6歲，腦癱病例組的線粒體DNA拷貝數(shù)隨著年齡的變化沒有顯著差異，但健康對照組～2歲與～4歲和～6歲線粒體DNA拷貝數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而且腦癱病例組和健康對照組線粒體DNA拷貝數(shù)都是～2歲最高。這可能與人體的生長發(fā)育的需求有關(guān)，0～2歲是兒童生長發(fā)育快速增長的時期，對各項物質(zhì)的需求也是最高的。因此線粒體的功能和含量可能與機體的生長和發(fā)育有關(guān)。但線粒體DNA拷貝數(shù)隨著年齡的變化還存在一定的爭議。Xia CY等[5]2437發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長，血液中的線粒體DNA拷貝數(shù)呈下降趨勢。但Lu B等[14]發(fā)現(xiàn)隨著年齡從2歲增加到4歲，健康對照的線粒體DNA拷貝數(shù)在健康兒童中的年齡差異顯著，呈現(xiàn)增加狀態(tài)，然而線粒體DNA拷貝數(shù)在腦癱兒童中的年齡差異不顯著，提示腦癱兒童的生長發(fā)育可能受到部分影響。痙攣型腦癱和非痙攣型腦癱線粒體DNA拷貝數(shù)比較，沒有顯著差異，這就說明線粒體DNA拷貝數(shù)在不同類型腦癱的鑒別意義有限。本研究Logistic回歸結(jié)果顯示，線粒體DNA拷貝數(shù)與腦性癱瘓的發(fā)生有關(guān)聯(lián)，呈正相關(guān)，說明線粒體DNA拷貝數(shù)的升高可能預(yù)示腦癱的發(fā)生。本研究ROC曲線分析表示：線粒體DNA拷貝數(shù)診斷腦癱的AUC為0.83，說明線粒體DNA拷貝數(shù)診斷腦癱具有一定的準(zhǔn)確性。通過ROC分析，綜合考慮敏感性和特異性時，診斷腦癱的最佳線粒體DNA拷貝數(shù)閾值為94.62個/細胞，其相應(yīng)的敏感性為79.00%，特異性為78.00%。

腦性癱瘓患者腦部血流量減少這一事實表明它與缺氧有很強的聯(lián)系[16]。在發(fā)育中的大腦中，氧氣不足和葡萄糖攝取受損會使細胞能量儲備耗盡，進而導(dǎo)致腦損傷[17]。能量消耗和氧化應(yīng)激是新生兒腦損傷的早期事件[18]。在病理狀態(tài)下，活性氧和抗氧化劑之間的不平衡和NO 誘導(dǎo)的氮自由基等損傷因子都會導(dǎo)致氧化應(yīng)激[19]?；钚匝跛缴邔?dǎo)致線粒體釋放活性氧爆發(fā)，進而導(dǎo)致線粒體的破壞，這種破壞可能在線粒體間擴散，損害細胞本身[20]。線粒體缺乏保護性組蛋白和有效的修復(fù)機制，所以線粒體DNA更容易受到氧化和其他基因毒性損傷[5]2435。研究發(fā)現(xiàn)線粒體功能障礙與結(jié)直腸癌和多種神經(jīng)疾病有關(guān)，例如阿爾茨海默氏病(AD)、創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)、抑郁癥、中風(fēng)和帕金森氏病(PD)[21- 22]。線粒體功能的障礙必然導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的障礙，進而導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生。線粒體DNA拷貝數(shù)直接體現(xiàn)了線粒體的狀態(tài)，不同疾病線粒體DNA拷貝數(shù)改變可能不同，要根據(jù)病因和臨床表現(xiàn)做具體分析。腦癱的診斷需要臨床醫(yī)師豐富的經(jīng)驗和家長的全力支持，但目前廣西基層醫(yī)師水平參差不齊，容易造成腦癱的誤診和漏診，給國家、社會乃至家庭帶來不可挽回的遺憾，因此尋找腦癱的早期診斷標(biāo)志物是我們目前急需解決的問題。本研究表明腦癱兒童和正常兒童的線粒體DNA拷貝數(shù)確實存在顯著差異，而且線粒體DNA拷貝數(shù)對于腦癱具有一定的診斷價值，因此線粒體DNA拷貝數(shù)未來可能作為腦癱的診斷標(biāo)志物為兒童腦癱的早期診斷提供理論依據(jù)。