林超群，李維納，邱波，范學(xué)政

[1. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院(光明)神經(jīng)外科，廣東 深圳 518106；2. 廣西柳州愛(ài)爾眼科醫(yī)院白內(nèi)障與青光眼科，廣西 柳州 545005]

隨著老年化席卷全球，腦卒中在全球發(fā)病率進(jìn)一步上升，其中缺血性腦卒中占其發(fā)病率的70%，且致死率極高，即使病后生存，其致殘率也居高不下[1]。在20世紀(jì)90年代，各國(guó)科學(xué)家開(kāi)始了神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)的深入研究[2]，研究表明[3]腦缺氧往往會(huì)導(dǎo)致NSCs的增殖能力和分化能力受到抑制，甚至發(fā)生凋亡，而且NSCs對(duì)缺氧比其他類(lèi)型的細(xì)胞[4]更敏感，缺氧后NSCs可能發(fā)生延遲死亡[5]。在缺血性腦卒中動(dòng)物模型中，內(nèi)源性NSCs能促進(jìn)大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)，在缺血性腦卒中修復(fù)的機(jī)制中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[6]。星形膠質(zhì)細(xì)胞可以分泌多種可溶性因子，能和NSCs發(fā)生一系列的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)功能，因此，星形膠質(zhì)細(xì)胞在缺血缺氧性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用也不可忽視[7]。如果我們能找到一種藥物，能促進(jìn)NSCs分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元，并且可以在缺氧環(huán)境下保護(hù)NSCs，避免NSCs的增殖能力和分化能力受到抑制，這種藥物可能對(duì)缺血性腦卒中至關(guān)重要。

國(guó)內(nèi)外使用中醫(yī)中藥治療缺血性腦卒中成為了21世紀(jì)研究的新熱點(diǎn)[8]。國(guó)內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)血塞通膠囊可明顯增加梗死區(qū)腦組織神經(jīng)干細(xì)胞的增殖能力及分化能力[9]，但血塞通注射液對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力及分化能力的影響少見(jiàn)報(bào)道。缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)為缺氧環(huán)境中非常重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，對(duì)NSCs增殖、分化發(fā)揮著關(guān)鍵作用[10-11]。實(shí)驗(yàn)證明，在缺氧環(huán)境中，NSCs的增殖和分化與HIF-1的表達(dá)呈正相關(guān)[12]。HIF-1分為HIF-1α和HIF-1β兩個(gè)亞基，HIF-1的活性主要由HIF-1α決定[13]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種能促進(jìn)顱內(nèi)新生血管形成的細(xì)胞因子，在缺氧環(huán)境中受到HIF-1的調(diào)控[14]。本文建立缺氧NSCs模型及無(wú)缺氧NSCs模型[15]，擬探討在缺氧環(huán)境中，血塞通注射液與星形膠質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞的相互關(guān)系，并且研究血塞通注射液通過(guò)調(diào)控HIF-1α-VEGF通路促進(jìn)NSCs增殖能力及分化能力，為進(jìn)一步闡述血塞通注射液治療缺血性腦卒中的機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原代NSCs的提取培養(yǎng)(胎鼠海馬來(lái)源) 雌性SD大鼠(8周齡，體重240～280 g)購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)根據(jù)國(guó)家《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》、《廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理辦法》以及中國(guó)科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心規(guī)章制度執(zhí)行，本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國(guó)科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后進(jìn)行。使用頸部脫臼的方法結(jié)束孕14 d SD大鼠的生命，在無(wú)菌操作臺(tái)，0 ℃環(huán)境中腹部解剖實(shí)驗(yàn)大鼠，取出胎鼠，分離出胎鼠的大腦，顯微鏡下解剖出胎鼠海馬組織，顯微剪均勻剪碎海馬組織，用0.25%的胰酶(美國(guó)Gibco公司)消化5 min，10%胎牛血清(北京索萊寶科技有限公司)終止消化，800 r/min、離心半徑9.5 cm離心5 min，棄上清，加入NSCs完全培養(yǎng)(DMEM/F12+2%B27+20 ng/ml EGF+20 ng/ml bFGF+1%雙抗)(DMEM/F12培養(yǎng)基、B27細(xì)胞補(bǔ)充添加劑、雙抗均為美國(guó)Gibco公司；EGF、bFGF均為美國(guó)PeproTech公司)后，仔細(xì)吹打均勻重懸，過(guò)400目細(xì)胞篩網(wǎng)，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，把細(xì)胞密度調(diào)整為5×105/ml。在溫度37 ℃，二氧化碳濃度為5%的恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)中培養(yǎng)，3 d換液，7 d傳代，每天在顯微鏡下觀察NSCs的狀態(tài)，取第2代懸浮神經(jīng)干細(xì)胞球進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2 NSCs免疫熒光鑒定 使用濃度為100 μg/ml的多聚賴(lài)氨酸預(yù)先包被24孔板爬片，PBS 輕柔沖洗3次，取吹打均勻的第2代懸浮神經(jīng)干細(xì)胞200 μl 懸于24孔板爬片上，放入恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，細(xì)胞貼壁后，4%多聚甲醛固定30 min，PBS 輕柔沖洗3次；加入0.3%Triton X-100(美國(guó)Amresco公司)通透30 min，PBS輕柔沖洗3次；加入10%驢血清(美國(guó)Jackson 公司)37 ℃封閉1 h，不洗，加入一抗(小鼠抗兔多克隆抗體Nestin，美國(guó)Abcam公司)，4 ℃孵育過(guò)夜；PBS輕柔沖洗3次；在避光環(huán)境下加入同源熒光二抗(ab150125，美國(guó)Abcam公司)室溫孵育1 h，PBS輕柔沖洗3次；DAPI(北京雷根生物技術(shù)有限公司染核)，PBS輕柔沖洗3次，取出爬片后置于防脫載玻片上(預(yù)先滴加抗熒光淬滅劑)，封片，使用倒置熒光顯微鏡(日本Nikon 公司)觀察染色結(jié)果。

1.3 細(xì)胞增殖/抑制CCK8 實(shí)驗(yàn)CCK8試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，用Accutase分離液(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)消化第2代懸浮神經(jīng)干細(xì)胞球，消化充分后細(xì)胞球消失，形成多個(gè)懸浮單細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，以1×104個(gè)/孔的細(xì)胞密度種于96孔板中，分組加入不同濃度血塞通注射液(分別為0 g/L、0.25 g/L、0.5 g/L、0.75 g/L、1 g/L、1.25 g/L；湖北清大康迪藥業(yè)有限公司)，培養(yǎng)3 d后，每孔加入10 μl CCK8試劑，37 ℃環(huán)境下孵育2 h，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)各孔的吸光度值，記錄數(shù)據(jù)并統(tǒng)計(jì)。建立缺氧NSCs模型及無(wú)缺氧模型，缺氧模型為37 ℃，5%空氣，90%N2，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境。無(wú)缺氧模型為37 ℃，5%CO2，95%空氣的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境。將NSCs分為無(wú)缺氧組、無(wú)缺氧聯(lián)合血塞通注射液組、缺氧組、缺氧聯(lián)合血塞通注射液組。4組不同細(xì)胞分別接種于96孔板，無(wú)缺氧組和無(wú)缺氧聯(lián)合血塞通注射液組細(xì)胞在無(wú)缺氧環(huán)境中培養(yǎng)24 h。缺氧組和缺氧聯(lián)合血塞通注射液組細(xì)胞在缺氧環(huán)境中培養(yǎng)24 h，然后每孔加入10 μl CCK8 試劑，37 ℃環(huán)境下孵育2 h，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)各孔的吸光度值，記錄數(shù)據(jù)并統(tǒng)計(jì)。

1.4 NSCs誘導(dǎo)分化及免疫熒光實(shí)驗(yàn) 為了研究缺氧狀態(tài)下血塞通注射液對(duì)NSCs分化能力的影響，使用干細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(含2%FBS 的DMEM培養(yǎng)基)對(duì)NSCs進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)3 d后進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組及血塞通注射液給藥組，其中藥物濃度為1 g/L。兩組細(xì)胞在缺氧環(huán)境中培養(yǎng)1 d，然后在無(wú)缺氧患者中繼續(xù)培養(yǎng)2 d。GFAP標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞，Tuj-1標(biāo)記神經(jīng)元，MBP標(biāo)記少突膠質(zhì)細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)3 d后，4%多聚甲醛固定30 min，PBS輕柔沖洗3次；加入0.3%曲拉通Triton X-100通透30 min，PBS 輕柔沖洗3次；加入10%驢血清37 ℃封閉1 h，不洗，分別加入一抗(兔抗羊多克隆抗體GFAP、小鼠抗兔多克隆抗體Tuj1、羊抗兔多克隆抗體MBP；美國(guó)Abcam公司)，4度孵育過(guò)夜；PBS輕柔沖洗3次；在避光環(huán)境下加入同源熒光二抗(ab150079、ab150181，美國(guó)Abcam公司)室溫孵育1 h，PBS輕柔沖洗3次；DAPI染核，PBS輕柔沖洗3次，取出爬片后置于防脫載玻片上(預(yù)先滴加抗熒光淬滅劑)，封片，使用熒光顯微鏡觀察染色結(jié)果。

1.5 Western blot實(shí)驗(yàn) 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中Nestin、Tuj1、GFAP、MBP、HIF-1α蛋白的表達(dá)。分別收集各實(shí)驗(yàn)細(xì)胞后，提取相應(yīng)實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞總蛋白(使用RAPI裂解)，通過(guò)BCA法檢測(cè)蛋白濃度，并且調(diào)整濃度使各組一致，加入5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，95 ℃煮樣5～10 min。配制10%分離膠和5%濃縮膠，待膠凝固后準(zhǔn)備加樣電泳；每孔上樣量20 μg，蛋白電泳條件為120 V 90 min；準(zhǔn)備與電泳凝膠合適大小的PVDF膜，用甲醇浸泡20 s使膜激活，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜夾兩面各放置1塊海綿和3塊濾紙，凝膠和膜的放置順序?yàn)檗D(zhuǎn)膜夾黑面-凝膠-PVDF 膜-白面，轉(zhuǎn)膜條件為300 mA 90 min；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，不洗，用含5%脫脂牛奶的TBST封閉液搖床上室溫封閉1 h；膜不洗，根據(jù)預(yù)染蛋白marker分子量大小分別裁剪不同位置的分子量抗體，孵一抗Nestin(1∶1 000)、Tuj1(1∶1 000)、GFAP(1∶1 000)、MBP(1∶1 000)、HIF-1α(1∶500)，內(nèi)參為GAPDH(1∶2 000)，4 ℃過(guò)夜；第2天一抗室溫?fù)u床30 min，TBST洗膜3次，每次10 min，室溫?fù)u床孵育相應(yīng)山羊抗小鼠標(biāo)記二抗(1∶5 000)1 h，TBST再洗3次，每次10 min， 用ECL顯色及化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行曝光，保存圖片數(shù)據(jù)并分析。

1.6 qRT-PCR實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)照組及血塞通注射液給藥組細(xì)胞后，使用Trizol法提取RNA。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)中的步驟提取RNA。分光光度法測(cè)定RNA濃度和純度。然后按試劑盒說(shuō)明書(shū)合成逆轉(zhuǎn)20 μl cDNA。其樣本cDNA稀釋10倍為SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的最佳模板濃度。25 μl PCR反應(yīng)體系：2X Fermentas MaximaTM SYBR Green/ROX qPCRMaster Mix 12.5 μl，模板(cDNA 稀釋10 倍)1 μl，引物F和R 5 pmol/μl mix 1 μl，dH2O 10.5 μl。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min，94 ℃ 15 s和60 ℃ 30 s，一共循環(huán)45次， 95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s。從60 ℃～95 ℃，每上升0.5 ℃取一次熒光值，最后生成融解曲線(xiàn)。所有樣本均重復(fù)檢測(cè)3次，計(jì)算出Ct值，各基因mRNA相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法進(jìn)行計(jì)算分析。PCR 引物合成VEGF 和及內(nèi)參照β-actin 引物。各基因的上下游引物序列分別為： VEGF：5′-CACCCACCCACATACATACA-3′ ；5′-CTCAAGTCCACAGCAGTCAA-3′；β-actin：5′-GCAGAAGGAGATCACAGCCCT-3′ ；5′-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3′；引物由廣州復(fù)能基因有限公司合成。

2 結(jié)果

2.1 原代胎鼠海馬來(lái)源NSCs形態(tài)及鑒定 分離出胎鼠的大腦，顯微鏡下解剖出胎鼠海馬組織，并提取NSCs。NSCs懸浮生長(zhǎng)，隨著增殖的NSCs逐漸融合，6～7 d后，肉眼就能辨認(rèn)出含有數(shù)千個(gè)細(xì)胞的大神經(jīng)球。原代NSCs在體外是神經(jīng)球樣的，通過(guò)顯微鏡可以看出NSCs懸浮球狀生長(zhǎng)，通過(guò)免疫熒光法證實(shí)表達(dá)NSCs的特異性標(biāo)記蛋白Nestin(見(jiàn)圖1)。

注：A：分離出胎鼠的大腦，可見(jiàn)胎鼠海馬組織；B：在顯微鏡鏡下觀察神經(jīng)球(200 μm)；C：在顯微鏡鏡下觀察神經(jīng)球(100 μm)；D：NSCs免疫熒光鑒定(DAPI，×100)；E：NSCs免疫熒光鑒定(Nestin，×100)；F：NSCs免疫熒光鑒定(Merge，×100)。

2.2 不同濃度血塞通注射液對(duì)NSCs活力的影響 使用CCK8實(shí)驗(yàn)對(duì)血塞通注射液的濃度進(jìn)行篩選，評(píng)估不同濃度血塞通注射液對(duì)NSCs活力的影響(見(jiàn)圖2)。可見(jiàn)1 g/L濃度的血塞通注射液能明顯增加NSCs的細(xì)胞活力，繼續(xù)增大血塞通注射液的濃度后，NSCs的活力無(wú)明顯變化。所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均來(lái)自于至少3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 缺氧狀態(tài)下血塞通注射液對(duì)NSCs細(xì)胞活力的影響 將NSCs分為無(wú)缺氧組、無(wú)缺氧+血塞通注射液組、缺氧組、缺氧+血塞通注射液組，其中血塞通注射液濃度為：1 g/L。使用CCK8實(shí)驗(yàn)評(píng)估血塞通注射液對(duì)缺氧狀態(tài)下NSCs的細(xì)胞活力的影響(見(jiàn)圖3)：①在無(wú)缺氧狀態(tài)中，給藥組的細(xì)胞活力升高；②在缺氧狀態(tài)中，NSCs的細(xì)胞活力明顯下降；③在缺氧狀態(tài)中，給藥組的細(xì)胞活力升高。所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均來(lái)自于至少3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

注：與0.25 g/L、0.5 g/L、0.75 g/L進(jìn)行比較，**表示P<0.01。

2.4 缺氧狀態(tài)下血塞通注射液對(duì)NSCs分化能力的影響 將NSCs分為缺氧組、缺氧聯(lián)合血塞通注射液組，使用干細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(含2%FBS的DMEM培養(yǎng)基)對(duì)NSCs進(jìn)行培養(yǎng)，兩組細(xì)胞在缺氧環(huán)境中培養(yǎng)1 d，然后在無(wú)缺氧狀態(tài)中繼續(xù)培養(yǎng)2 d。其中血塞通注射液濃度為1 g/L。使用免疫熒光實(shí)驗(yàn)評(píng)估血塞通注射液對(duì)缺氧狀態(tài)下NSCs分化能力的影響。通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)了缺氧聯(lián)合血塞通組中神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞的特異性蛋白 Tuj1、GFAP、MBP的熒光強(qiáng)度明顯高于缺氧組。在缺氧狀態(tài)下，1 g/L濃度的血塞通注射液能顯著提升NSCs的分化能力(見(jiàn)圖4)。NSCs誘導(dǎo)分化及免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示：在缺氧狀態(tài)下，血塞通注射液能顯著提升NSCs的分化能力。所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均來(lái)自于至少3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

注：*、#表示P<0.05，**表示P<0.01。

2.5 缺氧狀態(tài)下血塞通注射液調(diào)控HIF-1α-VEGF通路促進(jìn)NSCs增殖和分化 將NSCs分為缺氧組、缺氧聯(lián)合血塞通注射液組，使用干細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(含2%FBS 的DMEM培養(yǎng)基)對(duì)NSCs進(jìn)行培養(yǎng)，兩組細(xì)胞在缺氧環(huán)境中培養(yǎng)1 d。其中血塞通注射液濃度為1 g/L。我們使用Western blot analysis實(shí)驗(yàn)及Quantitative RT-PCR實(shí)驗(yàn)評(píng)估缺氧狀態(tài)下血塞通注射液促進(jìn)NSCs增殖和分化的能力是否與HIF-1α-VEGF通路相關(guān)(見(jiàn)圖5)。所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均來(lái)自于至少3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

注：+-代表：?jiǎn)渭內(nèi)毖踅M，++代表：缺氧聯(lián)合給藥組；A：通過(guò)Western blot analysis實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：缺氧聯(lián)合血塞通注射液組的HIF-1α蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，*表示P<0.05。B：通過(guò)Quantitative RT-PCR實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)：缺氧聯(lián)合血塞通注射液組的VEGF表達(dá)水平明顯升高(P<0.05 ) ，***表示P<0.01。

3 討論

本研究的目的是探討血塞通注射液對(duì)缺氧狀態(tài)下神經(jīng)干細(xì)胞活性、增殖和分化的影響，同時(shí)探討其作用機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，血塞通注射液的參考治療濃度為0.8～1 g/L[16-17]，我們的研究結(jié)果表明，血塞通注射液與增殖培養(yǎng)基中的NSCs共同培養(yǎng)，可提高缺氧狀態(tài)下NSCs的細(xì)胞活性，其最佳濃度為1 g/L。血塞通注射液與分化培養(yǎng)基中的NSCs共同培養(yǎng)，能顯著提升NSCs的分化能力。進(jìn)一步機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，缺氧狀態(tài)下血塞通注射液可調(diào)控HIF-1α-VEGF通路促進(jìn)NSCs增殖和分化。

近年來(lái)，祖國(guó)中醫(yī)藥治療神經(jīng)系統(tǒng)病變的藥物越來(lái)越受重視，其中，主要成分為三七總皂苷的血塞通注射液已廣泛應(yīng)用于臨床，血塞通注射液具有抑制血小板聚集，改善腦血供、促進(jìn)腦功能恢復(fù)的作用[18]。雖然在許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的動(dòng)物和細(xì)胞模型中，血塞通注射液是一種潛在的保護(hù)因子，臨床實(shí)踐也證明了其藥物安全性[19]，但它藥物作用的機(jī)制并沒(méi)有得到足夠的關(guān)注。

自從1992年Reynolds首次提出NSCs的概念后，通過(guò)NSCs治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病，給腦損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)帶來(lái)了新希望[2]。實(shí)驗(yàn)表明[20-23]，大腦缺氧發(fā)生后，內(nèi)源性NSCs的增殖、分化以及遷徙過(guò)程均受到缺氧因素的影響，從而誘發(fā)細(xì)胞程序性凋亡，影響腦損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)。HIF-1α是細(xì)胞內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄因子，無(wú)缺氧狀態(tài)下可被泛素化蛋白酶降解，但是缺氧狀態(tài)下泛素化蛋白酶大部分被抑制，因此在缺氧狀態(tài)下胞質(zhì)內(nèi)存在HIF-1α并可發(fā)揮作用。HIF-1α可以啟動(dòng)與細(xì)胞存活相關(guān)的多種基因的表達(dá)，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[24]。VEGF是一種細(xì)胞因子，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，與神經(jīng)損傷的修復(fù)密切相關(guān)[25]，有文獻(xiàn)證實(shí)在腦缺氧環(huán)境中，VEGF能夠促進(jìn)NSCs向腦損傷區(qū)域遷移[26]，并且能促進(jìn)神經(jīng)元增殖和新血管的形成[27]，有效地保護(hù)腦損傷區(qū)域的神經(jīng)功能。Harms KM等[28]發(fā)現(xiàn)，NSCs通過(guò)激活HIF-1a-VEGF信號(hào)通路在缺氧缺血環(huán)境促進(jìn)神經(jīng)元存活，在中風(fēng)后促進(jìn)神經(jīng)元的存活中的發(fā)揮重要作用。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)血塞通注射液與NSCs共培養(yǎng)，在缺氧狀態(tài)下Western blot analysis顯示HIF-1α蛋白水平在NSC分化過(guò)程中顯著升高，同時(shí)Quantitative RT-PCR顯示VEGF表達(dá)量也升高。揭示缺氧狀態(tài)下血塞通注射液可能調(diào)控HIF-1α-VEGF通路促進(jìn)NSCs增殖和分化，本研究有一定的局限性，后續(xù)研究需要設(shè)置模擬劑、抑制劑等組別進(jìn)行觀察，以及補(bǔ)充敲除HIF-1α基因的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由于本研究是在體外進(jìn)行的，因此在體內(nèi)缺氧條件下進(jìn)一步探討血塞通注射液對(duì)NSCs的影響仍有必要。雖然在我們的研究中HIF-1α和VEGF的表達(dá)水平發(fā)生了顯著的變化，但是目前尚不清楚血塞通注射液在NSCs中調(diào)控HIF-1α-VEGF通路的潛在機(jī)制，需要進(jìn)一步研究來(lái)揭示這一具體機(jī)制。