劉夢雅， 唐薇， 胡玉琳， 向澎， 路雪妍， 劉津

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，廣西 百色 533000)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是頭頸部最常見的惡性腫瘤，在中國南方地區(qū)，尤其是廣西、廣東、福建等地發(fā)病率較高，目前以放療結(jié)合化療的治療方案為首選治療方案，在腫瘤早期亦可選擇單純手術(shù)聯(lián)合化療的方式，以減少放療所產(chǎn)生的副作用：如咽干、咽鼓管功能不全等[1]。而腫瘤化療耐藥的產(chǎn)生常常導(dǎo)致治療腫瘤的復(fù)發(fā)和治療失敗。外泌體是由細(xì)胞或組織分泌的具有雙層膜結(jié)構(gòu)的小囊泡，直徑約40～150 nm，內(nèi)含多種脂質(zhì)、核酸、蛋白質(zhì)等[2]，在腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、化療耐藥中發(fā)揮著重要作用。鼻咽癌細(xì)胞來源的外泌體也受到越來越多的關(guān)注，但鼻咽癌耐藥細(xì)胞來源的外泌體對腫瘤細(xì)胞耐藥的影響目前研究較少。本文通過超速離心的方法，觀察腫瘤細(xì)胞來源的外泌體對腫瘤細(xì)胞的影響，探究鼻咽癌來源的外泌體在腫瘤耐藥中的作用和可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器 鼻咽癌細(xì)胞CNE-1來自實驗中心保存。RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶(美國Gibco公司)，抗人CD81、CD9抗體(Affinity公司)，抗人TSG 101、MVP、P-gp(武漢三鷹)，PKH67(美國sigma公司)，Transwell小室、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板(美國Corning公司)，激光共聚焦顯微鏡(日本OLYMPUS)、透射電子顯微鏡(型號 LVEM5)、超速離心機(jī)(美國Thermofisher)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及耐藥細(xì)胞系的建立 用含10%胎牛血清和90%的RPMI 1640培養(yǎng)基的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞生長穩(wěn)定后從0.01 mg/ml的濃度起加入順鉑注射液，細(xì)胞穩(wěn)定生長傳代3次后加入更高的藥物濃度， 如0.01 mg/ml、0.03 mg/ml、0.05 mg/ml、0.07 mg/ml、0.10 mg/ml、0.15 mg/ml、0.20 mg/ml、0.3 mg/ml、0.4 mg/ml，直至藥物濃度達(dá)到2 mg/ml ，利用CCK-8法檢測其耐藥指數(shù)，利用免疫印跡法檢測耐藥蛋白MVP、P-gp的表達(dá)變化。

1.3 CCK-8檢測細(xì)胞耐藥性 將呈對數(shù)生長的細(xì)胞用胰蛋白酶消化后重懸于完全培養(yǎng)基中，按照2 000個/孔的的濃度接種于96孔板中，待細(xì)胞完全貼壁后(8～10 h)將培養(yǎng)液換為含藥物濃度分別為1 μg/μl、2 μg/μl、5 μg/μl、8 μg/μl、10 μg/μl、15 μg/μl、20 μg/μl的培養(yǎng)基，48 h 后加入CCK-8檢測其OD值，分別計算耐藥細(xì)胞與敏感細(xì)胞的半數(shù)致死率IC50，兩者比值即為耐藥指數(shù)。

1.4 Transwell小室驗證耐藥的傳遞性 將細(xì)胞消化后接種于小室中，上層為耐藥細(xì)胞，下層為敏感細(xì)胞，培養(yǎng)72 h，下層濃度為70%～80%，胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，按步驟1.3接種于96孔板，通過CCK-8法檢測其耐藥性變化。

1.5 無外泌體血清的制備 將胎牛血清配平后置于超速離心機(jī)，以4 ℃、100 000 g離心18 h ，取上層80%液體為去除外泌體的血清。

1.6 外泌體的提取 收集細(xì)胞上清液，分別以4 ℃ 300 g、4 ℃ 2 000 g離心15 min去除死細(xì)胞及細(xì)胞碎片后置于-80°冰箱保存，需用時提前解凍上清液，以4 ℃ 10 000 g離心30 min，進(jìn)一步去除細(xì)胞碎片，4 ℃ 120 000 g離心75 min獲得外泌體沉淀，用PBS吹打沉淀，收集所有管的外泌體于1支管中，再次以4 ℃ 120 000 g離心75 min，所得黃褐色沉淀即為外泌體，最后用100 μl培養(yǎng)基(根據(jù)后續(xù)實驗情況，或用裂解液、無酶水)吹打重懸。

1.7 外泌體的鑒定 ①形態(tài)學(xué)觀察：透射電子顯微鏡(TEM)觀察外泌體形態(tài)：重懸exosome到50～100 μl 2%多聚甲醛中，取5 μl外泌體懸液加到載樣銅網(wǎng)上，將銅網(wǎng)放在50 μl 1%戊二醛液滴上5 min，雙蒸水清洗8次每次2 min，50 μl醋酸雙氧鈾液染色5 min，甲基纖維素液包被10 min(冰上操作)，吸去多余液體，空氣中干燥5～10 min，80 kV下觀察并拍攝電鏡照片。②外泌體表征蛋白檢測Western blot：將上述步驟1.6所得外泌體用裂解液重懸后，用BCA試劑盒檢測蛋白含量，加入1/4體積的上樣緩沖液，水浴加熱10 min進(jìn)行蛋白質(zhì)變性，然后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、蛋白孵育，檢測抗體CD9、CD81、TSG101表達(dá)情況。③NTA納米追蹤技術(shù)(粒徑分析)：將離心所得的外泌體重懸于1 ml PBS，密封冰上保存，使用潔凈的一次性樣品池，對光擦拭外管壁，確保無顆粒附著，不影響檢測光線，適度傾斜樣品池，延管壁緩慢注入外泌體溶液，避免氣泡產(chǎn)生，使用薄蓋蓋好樣品池，將樣品池放入儀器，按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程操作上機(jī)檢測。

1.8 外泌體細(xì)胞攝取實驗 將步驟1.6所得的沉淀用培養(yǎng)基吹打重懸后加入1 μl的PKH 67預(yù)混染料(1 μl PKH 67+1 ml Diluent C)，混勻后避光孵育20 min，再以4 ℃ 120 000 g離心75 min，得到染色后的外泌體沉淀，將其用PBS重懸后加入細(xì)胞濃度為50%的共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿中與細(xì)胞共同培養(yǎng)24 h，PBS清洗，多聚甲醛固定細(xì)胞20 min，用DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色，將無外泌體組命名為對照組，外泌體組命名為實驗組，共聚焦顯微鏡下觀察外泌體被細(xì)胞攝取的情況。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 檢測耐藥指數(shù) 耐藥細(xì)胞藥物半數(shù)抑制濃度IC50為(12.54±1)，耐藥指數(shù)為5.15，與敏感細(xì)胞相比耐藥蛋白MVP、P-gp表達(dá)明顯升高，如圖1。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)敏感細(xì)胞呈規(guī)則圓形結(jié)構(gòu)，排列整齊，耐藥細(xì)胞呈梭形條索狀，不規(guī)則排列。

圖1 耐藥細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及耐藥蛋白表達(dá)情況

2.2 Transwell共培養(yǎng) IC50明顯升高(4.83±0.32)，耐藥指數(shù)為1.98，如圖2。與耐藥細(xì)胞相比有統(tǒng)計學(xué)意義(F=6.22，P<0.05)。

圖2 外泌體共培養(yǎng)對細(xì)胞增值的影響

2.3 外泌體的鑒定 ①形態(tài)學(xué)觀察：將稀釋后的外泌體在透射電子顯微鏡下觀察，可以看到外泌體呈經(jīng)典茶托樣形態(tài)，大小不一，直徑約40～150 nm，如圖3A。②CD9、CD81、TSG101蛋白在外泌體中的表型鑒定：Western Blot檢測結(jié)果顯示，外泌體中富含 CD9、CD81、TSG101蛋白，如圖3B；③NTA粒徑分析：外泌體濃度為2.2×1011個/毫升，直徑大部分分布于50～150 nm之間，如圖3C。三者共同驗證所提取的物質(zhì)為由細(xì)胞所分泌的外泌體，證明實驗方法正確有效。

圖3 外泌體鑒定結(jié)果(形態(tài)、標(biāo)志蛋白、粒徑)

2.4 外泌體攝取情況 外泌體采用PKH67綠色熒光蛋白標(biāo)記，CNE-1細(xì)胞采用DAPI熒光進(jìn)行核染色，于共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h，共聚焦顯微鏡下我們觀察到細(xì)胞核被DAPI染色為藍(lán)色，外泌體被染為綠色，對照組無外泌體附著，實驗組細(xì)胞表面有外泌體附著，如圖4。

注：a.外泌體共孵育的細(xì)胞核，b.外泌體，c.外泌體與細(xì)胞共孵育，d.無外泌體的細(xì)胞核，e.無外泌體，f.無外泌體的細(xì)胞。

3 討論

外泌體是由細(xì)胞或組織分泌的直徑約40～150 nm的雙磷脂層微囊泡，我們體內(nèi)幾乎所有細(xì)胞都可以分泌外泌體，內(nèi)含蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等生物活性物質(zhì)[2]，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥等過程中發(fā)生重要作用，如在鼻咽癌中，外泌體來源的miR-24-3p通過抑制FGF11的表達(dá)來形成新的免疫逃逸[3]，可通過介導(dǎo)cicRNA促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增值、遷移和侵襲[4]，亦可通過介導(dǎo)miRNA促進(jìn)肺癌間充質(zhì)從而促進(jìn)肺癌的侵襲，巨噬細(xì)胞來源的外泌體可以促進(jìn)結(jié)腸癌的細(xì)胞遷移和侵襲[5]，腫瘤細(xì)胞來源的外泌體可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變[6]，癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)分泌的外泌體可促進(jìn)結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移和化療耐藥性[7]。本研究采用經(jīng)典超高速離心的方法獲取鼻咽癌耐藥細(xì)胞源性的外泌體，并發(fā)現(xiàn)鼻咽癌耐藥細(xì)胞源性的外泌體可促進(jìn)鼻咽癌敏感細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，表明鼻咽癌耐藥細(xì)胞源性的外泌體內(nèi)富含耐藥相關(guān)基因或蛋白，從而介導(dǎo)兩種或多種細(xì)胞間的信息傳遞。

鼻咽癌是頭頸部惡性腫瘤的常見腫瘤，其化療耐藥的產(chǎn)生常常導(dǎo)致腫瘤的轉(zhuǎn)移和治療失敗。為了探討鼻咽癌細(xì)胞的耐藥機(jī)制，我們將耐藥細(xì)胞與敏感細(xì)胞置于一個只能容納外泌體通過的小室中共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)外泌體可以介導(dǎo)該耐藥株的耐藥傳遞性，外泌體被細(xì)胞攝取的實驗也進(jìn)一步驗證了我們的觀點。由此我們認(rèn)為來源于耐藥細(xì)胞的外泌體中含有耐藥細(xì)胞信息，且能夠?qū)⒋诵畔鬟f給其他(敏感)細(xì)胞，導(dǎo)致其他細(xì)胞耐藥，進(jìn)而使全部細(xì)胞攜帶耐藥性，但這種傳遞性是有限度的，如在我們共培養(yǎng)之后的細(xì)胞耐藥性也只能提高1.98倍，我們認(rèn)為敏感細(xì)胞只能接受一部分的耐藥信息，而保留大部分的自身信息，從而只能有限度地提高耐藥性，當(dāng)然這可能也和共培養(yǎng)的時間以及次數(shù)有關(guān)。有研究證明[8]，在小鼠黑色素瘤細(xì)胞中，隨著時間的增加，外泌體的攝取率也逐漸增加，相關(guān)蛋白表達(dá)也隨之增高。

外泌體在心血管疾病[9]、骨關(guān)節(jié)炎[10]、抑郁癥[11]、肝癌[12]等多種疾病中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。鼻咽癌外泌體參與了腫瘤與受體細(xì)胞之間的通訊，通過改變鄰近腫瘤和間質(zhì)細(xì)胞的基因表達(dá)來控制病毒感染、免疫逃逸和腫瘤微環(huán)境[13]。崔兆磊等[14]等檢測了鼻咽癌患者治療前和轉(zhuǎn)移后以及健康人的血漿外泌體miR-BART的表達(dá)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn) miR-BART3轉(zhuǎn)移前后有較大的差別，且和腫瘤分期相關(guān)，即miR-BART3表達(dá)量越高，分期越晚。Lu J等[15]建立了過表達(dá)miR-9的穩(wěn)轉(zhuǎn)株，通過一系列細(xì)胞功能實驗發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌外泌體miR-9在血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)通過作用于MDK，抑制下游PI3K/AKT信號通路，進(jìn)而抑制血管生成，與鼻咽癌患者的生存期呈正相關(guān)。羅軼等[16]通過射線照射建立放療抵抗鼻咽癌細(xì)胞模型，并檢測放療抵抗的鼻咽癌細(xì)胞外泌體中miR-21表達(dá)含量明顯增高，通過外泌體共培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染等方法進(jìn)一步驗證了鼻咽癌放療抵抗細(xì)胞(R-CNE2)來源的外泌體miR-21在CNE2細(xì)胞放療抵抗中發(fā)揮重要作用。Li JX等[17]發(fā)現(xiàn)化療耐藥和末期患者血清中外泌體miR-106a-5p水平高于非耐藥和首期患者，并通過進(jìn)一步的實驗驗證了腫瘤的耐藥和外泌體源性miR-106a-5p相關(guān)，提出了外泌體miR-106a-5p是鼻咽癌患者潛在的診斷生物標(biāo)志物和藥物靶點。這些使我們對鼻咽癌化療耐藥發(fā)生機(jī)制有了更深入的了解，為后續(xù)治療鼻咽癌化療耐藥提供了思路。作為腫瘤微環(huán)境、液體活檢的重要研究對象，外泌體在鼻咽癌早期篩查、靶向治療、預(yù)后評估等方面具有重要的應(yīng)用前景[18-19]。 在本研究中，我們通過對外泌體共培養(yǎng)后的敏感細(xì)胞進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)后的敏感細(xì)胞對順鉑的耐藥性顯著提高，提示耐藥細(xì)胞來源的外泌體內(nèi)含有耐藥相關(guān)蛋白或基因，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞間信息的傳遞，但本研究存在局限性，具體何種耐藥基因參與表達(dá)調(diào)控機(jī)制，目前還有待于進(jìn)一步探索。

綜上所述，本研究證實，鼻咽癌耐藥細(xì)胞來源的外泌體可誘導(dǎo)敏感細(xì)胞對順鉑產(chǎn)生耐藥，其作用機(jī)制可能和其攜帶的非編碼RNA及相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)，這為我們今后研究由外泌體介導(dǎo)的鼻咽癌耐藥機(jī)制提供了基礎(chǔ)。