彭 亮， 李知敏， 祝珍芳

(江西科技師范學院藥學院，江西南昌330013)

1 引言

蒺藜為蒺藜科蒺藜屬植物Tribulus terrestris L.的干燥成熟果實，別名刺蒺藜、硬蒺藜、白蒺藜，其果實始載于《神農本草經》，列為上品，功能“平肝解郁，活血祛風，明目，止癢，頭痛眩暈，胸肋脹痛，乳閉乳癰，目赤翳障，風疹瘙癢”。蒺藜化學成分的研究始于20世紀60年代，目前認為其主要成分有多糖類、生物堿、黃酮類、皂苷類和氨基酸等化合物［1］?，F代藥理學實驗證明，蒺藜中的總皂苷類物質具有抗癌、抗衰老、保護心腦血管、調節(jié)血糖、血脂和性強壯的作用［2-6］。

目前蒺藜皂苷在現代醫(yī)學和藥學中的研究運用越來越廣泛，而大孔吸附樹脂的優(yōu)點決定了它在皂苷成分的分離純化中具有廣泛的應用前景。本實驗采用大孔吸附樹脂對蒺藜中的總皂苷進行分離純化，并對分離純化工藝進行了優(yōu)化。

2 實驗方法及內容

2.1 試劑及儀器

試劑:菝葜皂苷元標準品(購自中國藥品生物制品檢定所，110744-200509);蒺藜藥材(江西省中藥研究院提供);AB-8、D101和HPD-450大孔吸附樹脂購自滄州寶恩化工公司;其余試劑均為分析純。

儀器:UV-2600型紫外-可見分光光度計(上海尤尼科);RE-52A旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮);BS224S型電子天平(賽多利斯)。

2.2 實驗方法

2.2.1 蒺藜皂苷的提取 取100g蒺藜藥材用70%乙醇(1∶10)于80℃水浴中提取2次，每次2 h。合并提取液，減壓濃縮。攪拌下將上述濃縮液中加入適宜乙醇，靜置2 h，過濾，濾液減壓回收乙醇至無醇味，轉至量瓶，加蒸餾水定容至刻度，作為實驗母液，實驗時根據需要稀釋至相應體積。

2.2.2 大孔吸附的預處理 95%乙醇浸泡大孔吸附樹脂24 h，濕法裝柱后，蒸餾水洗至無醇味，用5%HCl浸泡2 h，用蒸餾水洗至中性;再用5%NaOH浸泡2 h，用蒸餾水洗至中性;最后用95%乙醇沖洗，直至流出液澄清，且蒸干后無殘留物，最后用蒸餾水洗至無乙醇味即可。

2.2.3 標準曲線的制備［7］精密稱取菝葜皂苷元對照品14.40 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容即得對照品溶液。精密吸取對照品溶液0.8、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 于三角瓶中，置水浴中揮干甲醇，各加10 mL高氯酸，在25℃水浴加熱顯色30 min后，取出，搖勻，置冰水浴中15 min，使反應停止，以甲醇同法制備空白，在310 nm處測定吸收值。以吸收值A為橫坐標，菝葜皂苷元對照品質量(mg)為縱坐標，繪制標準曲線。

2.2.4 皂苷的測定 取1 mL待測液，按照2.2.3項所述方法顯色后于310 nm下，以未加顯色劑的待測液為空白，用分光光度計測定其吸光度。由標準曲線所得回歸方程計算出待測液中總皂苷。

2.2.5 3種樹脂對蒺藜皂苷吸附量的測定 準確稱取經2.2.2項方法處理，并干燥的3種大孔吸附樹脂各1.0 g，置于磨口具塞三角瓶中，精確加入上柱樣品20 mL，密封后，于25℃放置24 h。待蒺藜皂苷被樹脂充分吸附后，過濾，測定濾液中總皂苷的濃度。按下面的公式計算對總皂苷的吸附量(mg/g)

其中:Q:吸附量(mg/g);Co:上柱液初始總皂苷濃度(mg/mL);C:濾液中總皂苷濃度(mg/mL);V:加入上柱液體積(mL);W:大孔吸附樹脂質量(g)。

2.2.6 蒺藜總皂苷解吸率的測定 將2.2.5項中過濾后得到的大孔吸附樹脂置于磨口具塞三角瓶中，再加入50 mL 95%的乙醇溶液，25℃放置2 h，使總皂苷解吸附，過濾后測定濾液中的總皂苷，按照下面的公式計算總皂苷的解吸率。

其中:D:解吸率(%);C:濾液中皂苷量(mg/mL);V:所加乙醇的體積(mL);Q:樹脂吸附皂苷的量(mg/g);W:大孔吸附樹脂的質量(g)。

2.2.7 上柱液皂苷濃度對吸附效果的影響 取2.2.1項中制備的實驗母液，配制皂苷濃度為0.276、0.323、0.369、0.420、0.461 mg/mL的上樣液。對預處理過的D101型樹脂進行濕法裝柱，分別取 40、34.3、30、26.7、24 mL 的上述上樣液(即保證上樣的總皂苷量均為11.056 1 mg)進行動態(tài)吸附，待吸附平衡后，先用蒸餾水沖洗后，再用70%乙醇洗脫，收集流出液，定容至相同體積后，測定皂苷。

2.2.8 最大上樣量的考察 對預處理過的大孔吸附樹脂進行濕法裝柱，用選定濃度的樣品液進行動態(tài)吸附，每1BV收集洗脫液，測定其中總皂苷。

2.2.9 pH值對皂苷吸附效果的影響 對預處理過的大孔吸附樹脂進行濕法裝柱，取30 mL選定濃度的樣品液(含總皂苷11.06 mg)6 份，將 pH 分別調整為 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和6.0，進行動態(tài)吸附，待吸附平衡后，先用蒸餾水沖洗后，再用70%乙醇洗脫，收集洗脫液，并定容至相同體積后，測定總皂苷。

2.2.10 乙醇濃度對洗脫效果的影響 對預處理過的大孔吸附樹脂進行濕法裝柱，取40 mL選定濃度的樣品液(含皂苷14.75 mg)4份調整至適當的pH，分別進行動態(tài)吸附，待吸附平衡后，先用蒸餾水沖洗，然后分別采用30%、50%、70%、90%乙醇進行洗脫，每1BV收集洗脫液，測定其中總皂苷。

3 實驗結果

3.1 標準曲線

以菝葜皂苷元對照品的質量為縱坐標，吸光值為橫坐標，做標準曲線，得菝葜標準品質量M(mg)與吸光值(A)的方程:M=0.980 3A-0.004 9(相關系數r=0.999 1)。菝葜皂苷元在0.230～0.720 mg間具有良好的線性范圍。

3.2 3種樹脂對蒺藜總皂苷的吸附與解析實驗

吸附量和解吸率是大孔吸附樹脂在提取和分離天然產物時需要考慮的重要參數，它不僅要求樹脂對目標物質具有較高的吸附量，同時還應該具備較高的解吸。

3.2.1 吸附量的實驗結果 表1列出了AB-8型、D101型、HPD-450型3種大孔吸附樹脂對蒺藜皂苷的吸附量。由表中數據可知，3種型號的吸附樹脂對蒺藜皂苷的吸附能力都比較強，吸附率均超過了70%。其中D101型的吸附力最強，吸附率達到83.1%，而AB-8型和HPD-450型的吸附能力相當。

3.2.2 解吸率的實驗結果 表2列出了AB-8型、D101型、HPD450型3種大孔吸附樹脂對蒺藜皂苷的解吸率。由表中數據可知，在95%的乙醇溶液中，3種型號的吸附樹脂對蒺藜皂苷的解吸附能力都比較強，解吸率均超過了70%。其中D101型的解吸附能力最強，解吸率達到91.96%。

表1 3種樹脂的皂苷吸附量(n=5)

表2 3種樹脂的解吸率(n=5)

通過分析表1和表2，綜合考慮吸附量和解吸率，在對蒺藜皂苷純化過程中，D101型吸附樹脂較AB-8型和HPD-450型吸附樹脂理想，因此，在以后的實驗中采用D101型大孔吸附樹脂對蒺藜總皂苷進行分離。

3.3 D101樹脂分離蒺藜總皂苷的工藝優(yōu)化

3.3.1 上柱液皂苷濃度對吸附的影響 用5份不同皂苷濃度，但具有相同皂苷質量的上柱樣品，考察皂苷濃度對D101型樹脂吸附效果的影響，結果如圖1所示。

圖1 上柱液皂苷濃度對吸附的影響曲線

由圖1可以看出，隨著上樣液中皂苷濃度的增加，洗脫液中的皂苷量呈先增加后減少的趨勢，在濃度為0.369 mg/mL時，洗脫液中的皂苷量最高。當溶液中總皂苷質量一定的情況下，皂苷濃度越低，所需的上樣體積越大，因此未充分吸附而隨上樣液流出的皂苷量也較大，導致被吸附的皂苷較少。而皂苷濃度較大時，皂苷分子之間競爭大孔吸附樹脂的吸附位點比較劇烈，導致溶液中的皂苷不容易與大孔吸附樹脂發(fā)生吸附，從而有較多的皂苷隨上樣液流出柱外。因此，在以后的實驗中，將上樣液的皂苷濃度調至0.369 mg/mL。

3.3.2 最大上樣量的考察 用皂苷濃度為0.369 mg/mL的上柱樣品對D101型大孔樹脂進行最大上樣量的考察。流出液中皂苷量與上樣液體積的關系如圖2所示(每BV上樣液含皂苷5.532 mg)。

由圖2可知，隨著上樣液體積的增加，流出液中皂苷量也逐漸增大。當上柱液體積小于6BV時，皂苷的泄露量較少。而當上樣液體積達到13BV時，流出液中的皂苷量與上樣液中的皂苷量接近，說明此時樹脂的吸附趨于飽和。為了減少皂苷的損失，上樣液的體積選為5BV。

圖2 D101動態(tài)吸附曲線

3.3.3 pH值對吸附的影響 取皂苷濃度為0.369 mg/mL的上柱液30mL(皂苷量11.06 mg)，調pH 為3.5、4.0、4.5、5.0、6.5和6.0，進行動態(tài)吸附，先用蒸餾水沖洗，再用70%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，定容至相同體積后測定皂苷，結果見圖3。

圖3 pH值對D101大孔吸附樹脂吸附量的影響

由圖3可知，pH值對D101吸附蒺藜皂苷的影響較大，隨著pH的增大，吸附效果呈先升高后下降的趨勢，當上樣液pH為5.0～5.5時，吸附效果最好。因此，在以后的實驗中，將上柱液的pH值調至5.0～5.5。

3.3.4 乙醇濃度對洗脫效果的影響 用皂苷濃度為0.369 mg/mL，pH為5.0～5.5的上柱樣品40 mL進行動態(tài)吸附(總皂苷為14.75 mg)，分別用30%、50%、70%、90%的乙醇溶液進行洗脫，洗脫液每1BV進行收集，結果如圖4所示。

圖4 不同濃度的乙醇溶液對D101樹脂中總皂苷分離效果的影響

由圖4可知，4種乙醇濃度的洗脫液洗脫6BV時，30%的乙醇洗脫率較低，僅有55.53%，而50%、70%和90%的洗脫率分別為81.34%、83.67%和83.25%，三者相差不大，而且70%和90%乙醇的洗脫情況非常相似，兩條洗脫曲線幾乎重疊。但是70%和90%的乙醇溶液洗脫峰在1～3BV時較尖銳，說明皂苷洗脫比較集中，在洗脫液體積為3BV時，洗脫率已達74.20%和74.84%，而50%乙醇此時的洗脫率僅為62.80%，而洗脫液的用量越大，帶入雜質的幾率也就越大，同時為了降低成本，今后的實驗中洗脫液濃度選用70%的乙醇，洗脫液體積為3BV。

3.3.5 最優(yōu)工藝驗證 選用D101大孔吸附樹脂，調整上柱液質量濃度0.369 mg/mL，pH值5.0～5.5，上樣體積5BV。用70%的乙醇作為洗脫劑，洗脫液體積3BV，測定洗脫液中蒺藜總皂苷的量為27.380 mg。將洗脫液干燥后稱定質量，計算干燥品中的總皂苷量為81.44%。

4 討論

大孔吸附樹脂是一種具有多孔立體結構人工合聚合物吸附劑，具有較好的吸附性能，物理化學穩(wěn)定性高、吸附容量大、選擇性好、吸附速度快、解吸條件溫和、再生處理方便、操作簡便、成本較低、可反復使用等優(yōu)點。幾年來，大孔吸附樹脂在總黃酮、總皂苷、總生物堿等天然藥物有效部位的分離純化過程應用越來越廣泛［8-12］。

實驗中，通過對AB-8、D101和HPD-450三種大孔吸附樹脂對蒺藜總皂苷的靜態(tài)吸附量和解吸率的考察，確定D101型大孔吸附樹脂較適合用于蒺藜總皂苷的分離純化，其分離純化工藝的最佳參數為:上柱液質量濃度0.369 mg/mL，pH值5.0～5.5，上樣體積5BV。用70%的乙醇作為洗脫劑，洗脫體積3BV，洗脫率可達70%以上。此時，分離產品中的總皂苷可達80%以上。

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