何智妍，黃正蔚

(上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院牙體牙髓病科，上海市口腔醫(yī)學研究所，上海市口腔醫(yī)學重點實驗室，上海200011)

牙菌斑生物膜是人類齲病和牙周病的主要致病因素，也是目前口腔微生物學和生態(tài)學研究的熱點。變異鏈球菌是齲病公認的主要致病菌，可在牙齒表面黏附和聚集，形成復雜的致齲性生物膜。細菌從浮游狀態(tài)到結(jié)成細菌生物膜，經(jīng)歷了從低密度到高密度、從無組織狀態(tài)到有組織狀態(tài)的過程，其生物學性狀也發(fā)生了很大改變。在細菌完成表面附著后，細菌間密度感應調(diào)控機制(quorum sensing)在生物膜的成熟和分化過程中發(fā)揮了重要的作用。密度感應調(diào)控機制是指微生物通過化學信號分子進行信息傳遞的一種形式，以微生物的群體密度為依據(jù)控制特定基因的表達，調(diào)節(jié)著細菌群體的許多生理功能［1-3］。因此，抑制細菌間密度感應效應可能成為控制生物膜相關感染的新靶點，而最直接的抑制方法之一就是使用密度感應拮抗劑。最早人們發(fā)現(xiàn)海洋紅藻生物D.pulchra自身能通過產(chǎn)生與密度感應受體AHL結(jié)構(gòu)相似的鹵代呋喃(圖1a)，與AHL受體結(jié)合后能抑制細菌的密度感應調(diào)控，從而保護自己不被細菌感染。之后，人們又發(fā)現(xiàn)該鹵代呋喃化合物能抑制病原體Serratia liquefaciens在固體培養(yǎng)基上的運動性，也能抑制S.liquefaciens質(zhì)粒熒光基因的表達(不影響細菌生長)，而且該化合物還能抑制致病菌V.harveyi產(chǎn)生細胞外毒素［4-6］。鹵代呋喃C-30具有與D.pulchra呋喃有相似的結(jié)構(gòu)式(圖1b、c)，也是一種密度感應拮抗劑，能有效抑制細菌生物膜形成的密度感應調(diào)控機制。本研究旨在觀察密度感應拮抗劑呋喃C-30對變異鏈球菌生物膜形成的影響，為開辟新的防齲途徑提供參考。

圖1 AHL、D.pulchra呋喃和鹵代呋喃C-30的結(jié)構(gòu)式

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

變異鏈球菌UA159(上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院口腔微生物研究室);牛心腦浸液培養(yǎng)基(brain heart infusion，BHI，Difco公司，美國);3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑嗅鹽(MTT，Sigma，美國);十二烷基硫酸鈉(SDS);二甲基甲酰胺(DMF，上海生工生物工程有限公司);呋喃C-30(根據(jù)參考文獻［7］自行合成，合成路線如圖2所示，溶于二甲亞砜中，濃度100 μg/mL);激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP2，德國);全自動酶標儀(Bio-Tek Elx800，美國);分光光度計(島津UV1601，日本)。

圖2 呋喃C-30的合成路線

1.2 呋喃C-30對浮游狀態(tài)變異鏈球菌生長的影響

變異鏈球菌(UA159)接種于牛心腦浸液培養(yǎng)基(BHI)，37℃培養(yǎng)過夜后，制備菌懸液，并調(diào)細菌密度為2×109CFU/mL，取新鮮菌懸液20 μL加入到盛有3 mL BHI培養(yǎng)基試管中，在37℃微需氧培養(yǎng)2 h后，加入已合成的密度感應拮抗劑呋喃C-30，并使其終濃度為2.0 μg/mL。另設不加呋喃C-30只含菌液和BHI培養(yǎng)基的試管作為空白對照，在37℃微需氧環(huán)鏡下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分別于培養(yǎng)后4、14和24 h用分光光度計檢測各組菌液的OD600。實驗設計3次平行重復，取均值。

1.3 呋喃C-30對變異鏈球菌形成生物膜的影響

1.3.1 MTT法檢測各組生物膜中的菌量

變異鏈球菌(UA159)接種于牛心腦浸液培養(yǎng)基(BHI)，37℃培養(yǎng)過夜，制備細菌密度為2×109CFU/mL菌懸液，并將其接種于96孔板(每孔新鮮菌懸液20 μL，BHI培養(yǎng)基180 μL)，37℃微需氧培養(yǎng)2 h后，隨機分為兩個實驗組和一個空白對照組，每組復3孔，同時設置調(diào)零孔。兩實驗組加入呋喃C-30，并使其終濃度分別為2.0、4.0 μg/mL，空白對照組不加呋喃C-30，再在37℃微需氧環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。確定形成生物膜后，吸去上清液，用無菌PBS溶液沖洗3次，以去除表面的浮游細菌。然后在每孔中加入 50 μL MTT溶液(5 mg/mL，溶解于無菌PBS緩沖液)，37℃暗箱孵育3 h，在這期間，活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細胞中。之后吸去MTT溶液，每孔內(nèi)加入100 μL三聯(lián)溶液(體積比10%的十二烷基硫酸鈉和體積比50%的二甲基甲酰胺溶于雙蒸水)，溶解胞內(nèi)的甲瓚結(jié)晶，再在37℃暗箱中孵育3 h后，用全自動酶標儀檢測每孔的OD600。實驗設計3次平行重復，取平均值。

1.3.2 激光共聚焦顯微鏡(CLSM)檢測各組生物膜中死活菌比例

取細菌密度為2×109CFU/mL的新鮮菌懸液接種于預置有直徑15 mm無菌蓋玻片的12孔板(每孔菌液200 μL，BHI培養(yǎng)基1 800 μL)，37℃微需氧培養(yǎng)2 h后，隨機分為兩個實驗組和一個空白對照組，每組復3孔，同時設置調(diào)零孔。兩實驗組加入呋喃 C-30，并使終濃度分別為 2.0、4.0 μg/mL，空白對照組不加呋喃C-30，再在37℃微需氧環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。確定形成生物膜后，吸去上清液，用無菌PBS溶液沖洗3次，以去除表面的浮游細菌，按照死菌、活菌熒光染色試劑盒(LIVE/DEAD BacLightBacterialViability Kits 7012，Molecular Probes，美國)說明進行染色，每一標本生物膜表面滴加200 μL熒光染液，室溫下避光孵育15 min后，激光共聚焦顯微鏡(CLSM)下觀察。

1.4 統(tǒng)計學分析

用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，不同濃度呋喃C-30對生物膜形成量的總體均數(shù)之間的比較用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 呋喃C-30對浮游狀態(tài)變異鏈球菌生長的影響

無論是含2.0 μg/mL呋喃C-30的實驗組還是空白對照組，細菌生長量均隨培養(yǎng)時間增加而增加，且各時間點之間兩兩比較均有顯著性差異(P＜0.05);而在相同培養(yǎng)時間點內(nèi)，實驗組與對照組相比，差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)(圖3)。提示2.0 μg/mL呋喃C-30對浮游態(tài)變異鏈球菌的生長無顯著影響。

2.2 呋喃C-30對變異鏈球菌形成生物膜的影響

變異鏈球菌在不同濃度呋喃C-30作用下所形成的生物膜的菌量(OD600)，與空白對照組相比，2.0 μg/mL和4.0 μg/mL的呋喃C-30均能明顯減少生物膜中的菌量，當加入濃度2.0 μg/mL的呋喃C-30后，生物膜中的菌量明顯降低，其OD600差值為0.219，而4.0 μg/mL的呋喃C-30組中生物膜菌量的減少幅度最大，為0.316。各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(圖4)。

圖3 2.0 μg/mL呋喃C-30對浮游變異鏈球菌生長的影響

圖4 各組生物膜中菌量的比較

2.3 呋喃C-30對生物膜中死活菌比例和結(jié)構(gòu)的影響

在不同濃度的呋喃C-30作用后，變異鏈球菌24 h生物膜激光共聚焦熒光圖像中，由于活菌的數(shù)量遠遠大于死菌，綠色熒光的強度遠遠高于紅色熒光的強度;所以同一視野疊加后，仍均呈綠色熒光。在對照組的共聚焦熒光圖像中，變異鏈球菌中活菌數(shù)量很多，而且細菌間相互集聚成團，結(jié)構(gòu)相對較致密(圖5-1c)。隨著呋喃C-30濃度的增加，變異鏈球菌的數(shù)量明顯減少，細菌間的集聚程度也開始減輕，細菌間的結(jié)構(gòu)逐漸稀疏(圖5-2c，5-3c)。同時，通過紅綠色熒光強度的比較，發(fā)現(xiàn)對照組和各組實驗活菌量占總菌量的比值分別為77.91%，78.22%和73.63%，差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

圖5 不同濃度呋喃C-30處理變異鏈球菌生物膜的CLSM圖像

3 討論

齲病的主要致病因素是由致齲細菌構(gòu)成的致齲性生物膜(牙菌斑)，生物膜內(nèi)的細菌在空間分布、形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理、代謝、對底物的降解或利用和對環(huán)境的抵抗能力等生物學特性都發(fā)生了改變，其毒力大增并對各類抗生素作用的敏感度下降，對惡劣環(huán)境和宿主免疫防御機制有很強的抗性、耐藥性［8-9］。因此，需要研發(fā)新的策略控制牙菌斑生物膜的感染。

變異鏈球菌從浮游的生長狀態(tài)到形成生物膜，涉及到多種相互交錯的信號轉(zhuǎn)導通路來協(xié)調(diào)細菌間的生理活動，以趨利避害。目前研究較多的是密度感應系統(tǒng)，是細菌根據(jù)細胞密度變化進行基因表達調(diào)控的一種生理行為，具有群體感應的細菌能產(chǎn)生并釋放稱為自體誘導物(Autoinducer)的信號分子，它隨著細胞密度的增加而增加，當積累到一定閾值時可與專一性受體結(jié)合從而啟動細菌中特定基因的表達［10］。細菌細胞通過群體感應信號分子與周圍環(huán)境進行信息交流，從而改變其生理活性，如共生、細菌毒性、運動性、孢子和生物膜的形成等，所以，抑制細菌密度感應被認為是一種新的抗感染策略，主要包括抑制信號分子的合成、密度感應拮抗劑的應用、密度感應信號失活化學劑的應用、密度感應淬滅酶的應用等等方法來抑制微生物的密度感應調(diào)控。其中最常用的方法之一就是使用密度感應拮抗劑，其作用機制是:依靠與密度感應信號分子在結(jié)構(gòu)上的相似性，與密度感應受體相結(jié)合，從而競爭性抑制密度感應的調(diào)控過程，最常用的密度感應拮抗劑是天然或合成的鹵代呋喃。

本文主要研究密度感應拮抗劑呋喃C-30對變異鏈球菌UA159生物膜形成的影響，結(jié)果顯示所選濃度(2.0 μg/mL)的拮抗劑對變異鏈球菌的生長不產(chǎn)生影響，但對變異鏈球菌生物膜的形成有顯著的抑制作用，而且隨著拮抗劑濃度的增加，生物膜的抑制程度也隨之增加，表明拮抗劑并不是通過殺菌或者抑制細菌的生長來抑制生物膜的形成。這一作用在對其他微生物的研究中也多有報道，如Louise D、Christensen等［11］(2007)研究中發(fā)現(xiàn)該鹵代呋喃C-30化合物對銅綠假單胞菌的缺陷株和野生株形成的生物膜存在著抑制作用，而且缺陷株受該化合物的抑制作用更加明顯;L?nn-Stensrud J等［12］同樣證實該化合物能有效抑制咽峽鏈球菌、中間鏈球菌等口腔鏈球菌生物膜的形成。

本研究通過激光共聚焦顯微鏡的觀察也發(fā)現(xiàn)生物膜的結(jié)構(gòu)也受到呋喃C-30的影響。隨著拮抗劑濃度的增加，生物膜中細菌堆積明顯降低，細菌間的結(jié)構(gòu)也變得稀疏，但是生物膜內(nèi)活菌占總菌量的比值不存在顯著性差異;結(jié)果都證實呋喃C-30可有效抑制變異鏈球菌UA159生物膜形成，可能是通過使用密度感應拮抗劑抑制密度感應調(diào)控系統(tǒng)。其具體作用機制仍有待進一步的研究。

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