郁建鋒，王 蕾，張燕萍，李建林，顧志良

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心 農(nóng)業(yè)部淡水魚類遺傳育種和養(yǎng)殖生物學(xué)重點(diǎn)實驗室，江蘇 無錫 214081；2.常熟理工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500）

肌動蛋白（actin）在維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞運(yùn)動和細(xì)胞分裂等過程中發(fā)揮著重要的作用.為了克隆鳡(Elopichthys bambusa)β-肌動蛋白(β-actin)全長cDNA，采用反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）和cDNA末端快速擴(kuò)增（rapid amplification of cDNA ends，RACE）技術(shù)，從鳡肌肉獲得全長為1775bp的β-ac?tin cDNA序列，其中包含1128bp的開放性閱讀框，編碼375個氨基酸，5′-非翻譯（UTR）區(qū)為98個核苷酸，3′-UTR區(qū)為549個核苷酸.核苷酸與氨基酸的同源性分析發(fā)現(xiàn)，鳡β-actin與鯉形目類硬骨魚的同源性均在98%以上，其中與團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）的同源性最高，分別為98.94%和99.73%，而與其他脊椎類動物如哺乳類、鳥類、兩棲類的同源性也分別在85%和97%以上，說明該基因在生物的分子進(jìn)化過程中具有很高的保守性.采用核苷酸系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示鳡β-actin與鯉形目類硬骨魚聚類在一起，且與團(tuán)頭魴的親緣關(guān)系最近.RT-PCR分析結(jié)果顯示，β-actin基因在鳡的肝臟、腎、腸、腦、心臟、鰓和肌肉等7個組織均有表達(dá).

鳡；β肌動蛋白；克?。槐磉_(dá)

肌動蛋白(actin)是構(gòu)成真核生物細(xì)胞骨架和肌小節(jié)的主要成分，在細(xì)胞生理活動方面，如維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞運(yùn)動和細(xì)胞分裂等過程中發(fā)揮著重要的作用[1,2].脊椎動物細(xì)胞肌動蛋白由多個基因組成的家族所編碼，一般由375～377個氨基酸殘基組成，有6種異構(gòu)體，分為α、β、γ三類：兩個橫紋?。é?骨骼肌型，α-心肌型），兩個平滑?。é?血管平滑肌型，γ內(nèi)臟平滑肌型），兩個細(xì)胞質(zhì)型（β和γ亞型）[3].在物種間，肌動蛋白的氨基酸同源性可高達(dá)70%以上，其中β-actin蛋白質(zhì)的氨基酸尤為保守，軟體類、節(jié)肢類、魚類、兩棲類、鳥類、哺乳類等不同類群動物的β-actin蛋白質(zhì)氨基酸同源性均在96%以上[4]，甚至在有些物種中如原雞、鼠和人的β-actin蛋白質(zhì)氨基酸同源性可達(dá)100%[5].包括硬骨魚類在內(nèi)的動物的β-actin基因已被大量克隆，其也成為物種進(jìn)化分類研究中的一個重要標(biāo)志.β-actin mRNA的表達(dá)水平較高，且和其他管家基因一樣為恒量表達(dá)，因此在測定其他基因mRNA的表達(dá)情況時，可以β-actin mRNA作為內(nèi)標(biāo)[6]．

鳡屬鯉形目，鯉科，雅羅魚亞科，鳡屬，為江河、湖泊中大型經(jīng)濟(jì)魚類之一.由于過去將鳡作為“害魚”的清除和近年來隨著自然環(huán)境的惡化、捕撈強(qiáng)度的增大等因素，鳡資源遭到了嚴(yán)重的破壞，種群數(shù)量急劇下降，已被列入國家重點(diǎn)保護(hù)瀕危及受威脅水生物種名錄[7].鳡β-actin基因的研究還未見報道，克隆鳡β-actin基因旨為其在鳡中的生物學(xué)功能研究及進(jìn)行其他基因的量化研究提供可靠內(nèi)參的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，提高內(nèi)參引物設(shè)計的正確性和特異性，同時也為揭示物種進(jìn)化提供了新信息．

1 材料與方法

1.1 實驗動物及總RNA提取

鳡由江蘇省蘇州市水產(chǎn)工程中心提供，魚齡為3個月，取其肌肉、腦、肝臟、心臟、鰓、腸和腎臟等7個組織，采用RNAiso Reagent（TaKaRa）分別提取上述組織的總RNA，并用DnaseⅠ處理純化后保存于-80℃．

1.2 鳡β-actin部分編碼序列的擴(kuò)增

按反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0.）要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系：2μL MgCl2(25mmol/ L)，1μL10×RT Buffer，1μL dNTP Mixture（10mmol/L each），0.25μL RNase Inhibitor，0.5μL AMV Reverse Transcriptase，0.5μL Random 9 mers，1μg總RNA，加RNase Free dH2O至總反應(yīng)體積為10μL.反應(yīng)條件：30℃×10min；42℃×30min；99℃×5min；5℃×5min.根據(jù)斑馬魚（Danio rerio）（AF057040.1）、和鯉魚（Com?mon carp）（M24113.1）設(shè)計β-actin保守區(qū)段特異性引物為BactinF：5′-ccagatcatgttcgagaccttc-3′和BactinR：5′-gaacctctcattgccaatggtg-3′.用于擴(kuò)增鳡β-actin cDNA的部分序列，反應(yīng)體系：10×PCR buffer 2.5μL，10 mmol/L dNTP Mixture 2μL(2.5mmol/L each)，10μmol/L引物BactinF/BactinR各1μL，rTaq（5U/μL）1μL，1 μL cDNA，dd H2O 17.3μL；PCR程序：94℃預(yù)變性3min；94℃×30sec，58℃×30sec，72℃×45sec，共35個循環(huán)；72℃延伸8min.擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測，膠回收目的片段，并克隆入pMD18-T后測序（上海桑尼生物公司測序）．

1.3 RACE擴(kuò)增鳡β-actin的mRNA的5′端和3′端序列

根據(jù)獲得的部分鳡β-actin基因序列設(shè)計用于5′-RACE和3′-RACE的特異性引物：Bactin5'in（5'-cacatagcagagcttctcct-3'）、Bactin3'in（5'-gtgacctgactgactacctc-3'），引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成.引物 3′race outer primer（5′-taccgtcgttccactagtgattt-3′）、3′race inner primer（5′-cgcggatcctccactagtgatttcactatagg-3′）、5′race outer primer（5′-catggctacatgctgacagccta-3′）、5′race inner primer（5′-cgcggatccacagcctactgatgatcagtcgatg-3′）分別來自于TaKaRa 3′-Full RACE Core Set Ver.2.0和5′-Full RACE Kit試劑盒．

5′-RACE按TaKaRa 5′-Full RACE試劑盒程序進(jìn)行.將制備好的cDNA用5′race outer primer/BactinR進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，再以5′race inner primer/Bactin5′in引物對第一輪的PCR產(chǎn)物進(jìn)行巢式PCR.PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并回收克隆入pMD18-T后測序．

3′-RACE按TaKaRa 3′-Full RACE Core Set Ver.2.0試劑盒程序進(jìn)行.用引物BactinF/3′race outer primer對制備的cDNA進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，然后用引物Bactin3'in/3′race inner primer進(jìn)行第二輪巢式PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并回收克隆入pMD18-T后測序．

1.4 序列分析

應(yīng)用BLAST工具將獲得的鳡β-actin基因的cDNA在網(wǎng)上進(jìn)行同源性比對分析，并推斷其開放閱讀框和編碼氨基酸的序列情況.將獲得的序列在DNAMAN5.0軟件上進(jìn)行分析，進(jìn)行物種間同源性比較.利用MEGA 4.1軟件中的Kimura 2-parameter法計算凈遺傳距離矩陣.以距離矩陣鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）建系統(tǒng)發(fā)生樹，通過自引導(dǎo)檢驗(bootstrap)獲得系統(tǒng)分支的置信度(重復(fù)次數(shù)為1000)．

1.5 鳡β-actin的組織表達(dá)檢測

RT-PCR方法檢測不同組織β-actin mRNA的表達(dá)分布，方法按反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0）程序進(jìn)行.PCR反應(yīng)體系和條件：0.2μL rTaq聚合酶(5U/μL)(TaKaRa)，2.5μL 10×PCR Buffer(without Mg2+)，2μL dNTP(2.5mmol/L each)，1.5μL MgCl2（25mmol/L），引物BactinF和BactinR各1μL(10pmol/L)，1μ L cDNA，加滅菌dH2O至25μL.PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5min；然后在95℃×30sec，60℃×30sec，72℃×30 sec，進(jìn)行22次循環(huán)；72℃延伸10min，RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定．

2 結(jié)果

2.1 鳡β-actin部分編碼序列的擴(kuò)增

以鳡肌肉總RNA為模板，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，再用引物BactinF/ BactinR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測.電泳檢測結(jié)果（見圖1）顯示，得到460bp PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，與設(shè)計的目的片段長度相一致，經(jīng)測序后獲得了該片段的核苷酸序列，與其他物種的β-actin基因進(jìn)行比對，確認(rèn)該序列為鳡β-actin基因編碼區(qū)的部分序列．

2.2 鳡β-actin基因的5′-RACE和3′-RACE擴(kuò)增

以鳡肌肉總RNA為模板，經(jīng)5′-RACE和3′-RACE的各兩輪PCR，分別獲得約在800bp和1.2kb較亮的條帶，與試驗預(yù)期的結(jié)果接近(見圖2).通過對上述兩個片段回收后克隆到pMD-18T載體中，經(jīng)測序后獲得了該兩個片段的核苷酸序列，與其他脊椎動物的β-actin基因比對，確認(rèn)這兩條序列分別為鳡β-actin基因的5′和3′端序列．

2.3 鳡β-actin基因全長cDNA和氨基酸的序列分析

經(jīng)克隆后測序和拼接，獲得全長為1775bp的β-actin cDNA序列，其中包含1128bp的開放性閱讀框，其起始密碼子是ATG，終止密碼子是TAA，編碼375個氨基酸，5′-UTR區(qū)為98bp，3′-UTR區(qū)為549 bp，polyA加尾信號AATAAA位于1740bp（見圖3）．

鳡β-actin核苷酸及氨基酸序列與其他物種進(jìn)行同源性比較發(fā)現(xiàn)，鳡β-actin與魚類、哺乳類、鳥類和兩棲類的氨基酸同源性在97%以上，核苷酸的同源性為85%至98.85%不等.鳡β-actin的核苷酸和氨基酸與鯉形目類的硬骨魚同源性較高，均在98%以上，其中與團(tuán)頭魴的核苷酸和氨基酸同源性最高，分別為98.94%和99.73%，與其他魚類的同源性次之，與哺乳類和兩棲類相對較低（見表1）.

2.4 β-actin的系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)所獲得的鳡β-actin基因CDS核苷酸序列，采集GenBank中其它物種包括人(Homo sapiens)（X00351.1）、牛(Bos Taurus)(AY141970.1)、小鼠（Mus musculus）（NM_007393.3）、紅原雞(Gallus)（NM_205518.1）、火雞（Melea?gris gallopavo）（AY942620.1）、團(tuán)頭魴（AY170122.2）、鯉魚（Common carp）（M24113.1）、草魚（Grass carp）(M25013.1)、鰱魚（Hypophthalmichthys molitrix）（AF301605.1）、斑馬魚（Danio rerio）（AF057040.1）、斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）（AY510710.2）、大西洋鮭（Salmo salar）（AF012125.1）、羅非魚（Tilapia mossambica）（AB037865.1）、松江鱸（Trachidermus fasciatus）（HM449124.1）、非洲爪蟾（Xenopus tropicalis）（BC082343.1）等脊椎動物的β-actin核苷酸序列，利用MEGA4.1軟件構(gòu)建了鳡和以上16種脊椎動物的β-actin基因分子進(jìn)化樹（見圖4）.結(jié)果表明鳡β-actin與團(tuán)頭魴、鯉魚、鰱魚和草魚聚類在一起，形成一個鯉形目魚類分支，且有較高的自展值．2.5 鳡β-actin基因的組織表達(dá)分析

圖1 鳡β-actin基因部分序列RT-PCR產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

圖2 鳡β-actin基因cDNA 5′-端和3′-端序列的5′-RACE和3′-RACE擴(kuò)增結(jié)果

表1 鳡與其它動物β-actin基因編碼區(qū)同源性比較

續(xù)表1

采用 RT-PCR方法檢測了β-actin基因mRNA在鳡腎臟、腸、鰓、心臟、肝臟、腦和肌肉等7個不同組織的表達(dá)情況．通過PCR條件優(yōu)化，β-actin基因在擴(kuò)增進(jìn)入平臺期前的循環(huán)數(shù)為22次，電泳結(jié)果顯示（見圖5），在約460bp獲得β-actin特異性片段，與預(yù)期設(shè)計的試驗結(jié)果相符，并發(fā)現(xiàn)這7個組織均有β-actin基因 mRNA的表達(dá)，并在表達(dá)量上基本一致．

3 討論

圖4 不同物種推導(dǎo)的β-actin核苷酸酸序列構(gòu)建的NJ樹（數(shù)字表示bootstrap值）

本研究成功地克隆了鳡β-actin的全長cDNA基因1775bp，其中5′非翻譯區(qū)（5′-UTR）為98bp，3′非翻譯區(qū)（3′-UTR）為549bp，1128bp的開放閱讀框（ORF），起始密碼子為ATG，終止密碼為TAA，共編碼375個氨基酸，在1740bp處存在AATAAA的polyA加尾信號序列.經(jīng)過β-actin核苷酸和氨基酸的同源分析，發(fā)現(xiàn)鳡與、牛、小鼠、紅原雞、火雞、團(tuán)頭魴、鯉魚、草魚、鰱魚、斑馬魚、斜帶石斑魚、大西洋鮭、羅非魚、松江鱸、非洲爪蟾等脊椎動物的同源性較高，核苷酸同源性在88%以上，氨基酸的同源性在97%以上，說明脊椎動物的β-actin基因在進(jìn)化過程中是非常保守的，氨基酸的同源性尤為保守.由于蛋白質(zhì)的進(jìn)化信息較少，因此如以β-actin蛋白質(zhì)作進(jìn)化分析，則可靠性較差.所以本文以核苷酸為研究對象進(jìn)行進(jìn)化分析，建立的進(jìn)化樹能較準(zhǔn)確地展示魚類、哺乳類、鳥類和兩棲類四類脊椎動物的親緣關(guān)系.鳡β-actin與鯉形目的團(tuán)頭魴的同源性最高，親緣關(guān)系最近，這和傳統(tǒng)的分類相符.β-actin基因能從種群層次上反映出脊椎動物的進(jìn)化規(guī)律，表明其可成為研究類群進(jìn)化的重要參考分子．

肌動蛋白是構(gòu)成真核生物細(xì)胞骨架和肌小節(jié)的主要成分，在維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞運(yùn)動和細(xì)胞分裂等細(xì)胞生理活動方面發(fā)揮著重要的作用.β-actin為肌動蛋白家族中的重要成員，屬細(xì)胞質(zhì)型肌動蛋白，在各組織中呈恒量表達(dá)[1，2，6].RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，鳡β-actin基因的mRNA在所采集的肌肉、心臟、肝、腎、腦、鰓和腸7個組織中均有表達(dá)，因此β-actin基因可以作為研究鳡其他基因表達(dá)的內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn).鳡β-actin基因的全長cDNA的克隆及表達(dá)研究為進(jìn)一步研究其在鳡生長、發(fā)育方面的生物學(xué)功能與其調(diào)控序列的研究奠定了基礎(chǔ)，也為鳡其他基因的研究打下一定的物質(zhì)基礎(chǔ)．

圖5 鳡β-actin基因表達(dá)檢測結(jié)果

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