曾岳岳， 黃正接， 羅 琪

2006年日本京都大學(xué)的Takahashi等［1］首次報(bào)道，將選擇的特定外源性轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入小鼠的成纖維細(xì)胞，可以成功誘導(dǎo)出多能性的類胚胎干細(xì)胞，他們把這類細(xì)胞命名為——誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS cell)。這一新的突破在理論上首次證實(shí)了已分化成熟的體細(xì)胞同樣可以被重編程而轉(zhuǎn)化為類胚胎干細(xì)胞，且成功地解決了難以突破的倫理及免疫排斥問題，為再生醫(yī)學(xué)增加了一個(gè)新途徑。運(yùn)用此重編程技術(shù)能從特定疾病的患者體內(nèi)提取成體細(xì)胞，進(jìn)而誘導(dǎo)成疾病特異iPS細(xì)胞。疾病特異iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)成功更為體外研究遺傳疾病發(fā)生、發(fā)展和組織形成提供了更加廣泛和大量的研究模型，并將有力推動(dòng)基因治療和藥物研發(fā)。但是，重編程外源基因組及使用病毒載體會(huì)影響iPS細(xì)胞基因組，即可能引發(fā)潛在的插入性腫瘤和干擾誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化。因此，尋找合適的載體是誘導(dǎo)多能干細(xì)胞技術(shù)的重要研究課題。載體是由質(zhì)粒、噬菌體及病毒衍生而來的，具有攜帶功能的DNA分子，在載體中可插入外源基因片斷，通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或利用病毒進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制導(dǎo)入到一個(gè)宿主細(xì)胞中，并在其中進(jìn)行復(fù)制或表達(dá)。

1 使用病毒載體誘導(dǎo)iPS細(xì)胞

1.1 以逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒為載體 2007年Okita 等［2］報(bào)道，以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體，將 Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4 4種因子導(dǎo)入人類成纖維細(xì)胞，成功誘導(dǎo)成類胚胎干細(xì)胞。幾乎與之同時(shí)，美國(guó)科學(xué)家Yu等［3］也成功地將人類成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成類胚胎干細(xì)胞。與Okita研究組所不同的是，Yu等運(yùn)用的載體為慢病毒，所采用的轉(zhuǎn)錄因子是通過自篩而確定的4種因子組合，即 Oct3/4、Sox2、Nanog和 Lin28。結(jié)果顯示，生成的iPS細(xì)胞與人的類胚胎干細(xì)胞特性高度一致。隨后，研究小組將iPS細(xì)胞注入先天免疫缺陷的裸鼠皮下，得到包含三胚層細(xì)胞的畸胎瘤，進(jìn)一步證實(shí)其具有類似胚胎干細(xì)胞的發(fā)育潛能。使用逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒作為載體轉(zhuǎn)染體細(xì)胞誘導(dǎo)成iPS細(xì)胞的方法，因其直接使外源性基因和載體整合到受體體內(nèi)的基因組，會(huì)引起插入突變以干擾正常的iPS細(xì)胞系的功能，而細(xì)胞中殘余的外源因子序列的表達(dá)會(huì)影響分化，甚至有導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的危險(xiǎn)性。特別是原癌基因c-Myc的導(dǎo)入，由其構(gòu)建的嵌合體小鼠中約20%發(fā)生了腫瘤［3］。因此，目前很多學(xué)者已采用其他方法替代原癌基因c-Myc的轉(zhuǎn)導(dǎo)，而以逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒為載體誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的臨床應(yīng)用也受到了極大的限制。

1.2 以腺病毒為載體 2008年 Stadtfeld等［4］報(bào)道，使用腺病毒載體(adenoviral vectors)轉(zhuǎn)染Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4 4種因子，成功地將小鼠肝細(xì)胞改造成iPS細(xì)胞。研究者使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)和 Southern blotting等方法未發(fā)現(xiàn)腺病毒載體基因組及轉(zhuǎn)導(dǎo)因子基因組整合到宿主細(xì)胞基因組中的跡象。與逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒相比，腺病毒載體可以使外源基因組不會(huì)整合到宿主細(xì)胞基因組當(dāng)中，解決了外源基因組對(duì)iPS細(xì)胞分化干擾的難題。然而，以腺病毒為載體誘導(dǎo)iPS 細(xì)胞的效率非常低(0.000 1% ～0.001 8%)，比逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體的誘導(dǎo)率(0.1%)低很多，這就限制了其臨床應(yīng)用。

2 使用質(zhì)粒載體誘導(dǎo)iPS細(xì)胞

2.1 以質(zhì)粒為載體 2008年日本學(xué)者Okita等［5］使用質(zhì)粒(plasmid)為載體，攜帶轉(zhuǎn)染所需的因子基因，成功地將小鼠成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成類胚胎干細(xì)胞——iPS細(xì)胞。這種方法不僅防止了病毒載體基因組整合到宿主細(xì)胞基因組中，同時(shí)可以防止外源基因干擾iPS細(xì)胞的分化。Okita等利用質(zhì)粒的自我復(fù)制和轉(zhuǎn)錄等特性，設(shè)計(jì)了兩種攜帶轉(zhuǎn)染因子的質(zhì)粒改造小鼠成纖維細(xì)胞，一種為pCX-OKS-2A，其由一段2A肽(來自口蹄疫病毒，具有自我清除作用)攜帶Oct4、Sox2和Klf4 3種轉(zhuǎn)導(dǎo)基因;另一種是pCX-c-Myc，由一段2A肽攜帶c-Myc轉(zhuǎn)染基因。兩種質(zhì)粒經(jīng)多次瞬間轉(zhuǎn)染，將小鼠成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成iPS細(xì)胞。此法大大消除了插入性腫瘤形成的風(fēng)險(xiǎn)及再激活癌基因的可能性。但其仍然無法突破一個(gè)障礙——iPS細(xì)胞誘導(dǎo)率極低。采用此法轉(zhuǎn)導(dǎo)1×106個(gè)成體細(xì)胞只成功改造了1～29個(gè)iPS細(xì)胞，而在同樣的實(shí)驗(yàn)條件下，采用逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體卻能成功轉(zhuǎn)染1～1 000個(gè)iPS細(xì)胞［6］。西班牙學(xué)者Gonzalez等［7］改進(jìn)了Okita研究組的方法，他們采用一個(gè)質(zhì)粒載體就將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞成功地誘導(dǎo)出iPS細(xì)胞。并設(shè)計(jì)出一個(gè)含Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc 4種轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的多順反子質(zhì)粒載體pCAG-OSKM，通過瞬間轉(zhuǎn)染的方法改造小鼠胚胎成纖維細(xì)胞成iPS細(xì)胞。但誘導(dǎo)率仍很低。

2.2 以oriP/EBNA1質(zhì)粒為載體 Yu等［8］于2009年利用oriP/EBNA1質(zhì)粒，首次生成無外源基因重編程的人iPS細(xì)胞。EBNA1和oriP是EB病毒(epstein-barr virus，EBV)中與復(fù)制和保持病毒基因組游離性的重要基因元件。具有oriP/EBNA1的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人靶細(xì)胞后不整合，并可長(zhǎng)期穩(wěn)定存在，不會(huì)造成宿主細(xì)胞的突變。同時(shí)，由于其具有增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄及免疫逃逸等功能，使質(zhì)粒攜帶的目的基因能夠獲得較高的轉(zhuǎn)染效率［9］。Yu工作小組經(jīng)研究得出，當(dāng)oriP/EBNA1質(zhì)粒只整合 Oct4、Sox2、Nanog及 Lin28 4種外源基因，其改造人新生兒包皮成纖維細(xì)胞的成功率為0.1%，但當(dāng)再增加c-Myc和Klf4轉(zhuǎn)導(dǎo)基因后，其誘導(dǎo)成功率則增加10倍。

3 使用酶切系統(tǒng)誘導(dǎo)iPS細(xì)胞

3.1 利用 Cre/LoxP重組系統(tǒng) Soldner等［10］從帕金森病患者身上提取成纖維細(xì)胞和利用強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)的慢病毒載體，通過酶切Cre/LoxP重組系統(tǒng)成功地培育出不含外源基因的人iPS細(xì)胞。酶切Cre/LoxP系統(tǒng)可以使某一基因在特定的組織、細(xì)胞中，在細(xì)胞分化，成熟過程的某一時(shí)段被剔除，以減輕其帶來的副作用。這雖能除去外源因子序列，但載體序列仍會(huì)有殘留，因此仍可能造成插入性突變。此外采用這種方法誘導(dǎo)的成功率仍然很低，轉(zhuǎn)染Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc 4種基因后，其誘導(dǎo)成功率只有0.01%［11］。

3.2 利用piggyBac轉(zhuǎn)座子 Yusa等［12］報(bào)道，利用piggyBac轉(zhuǎn)座子方法，將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞成功地改造成iPS細(xì)胞。piggyBac是一種從粉紋夜蛾(trichoplusia ni.)中分離到的、具有TTAA插入位點(diǎn)特異性的DNA轉(zhuǎn)座子。piggyBac可在昆蟲基因組中準(zhǔn)確切離，轉(zhuǎn)化頻率較高，且不受宿主因子的限制［13］。Yusa研究小組設(shè)計(jì)了含有piggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)、具有自我清除作用的F2A肽及T2A肽的載體，轉(zhuǎn)染 Oct4、Sox2、Klf4和 c-Myc基因。此載體能通過piggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)形成的轉(zhuǎn)座酶及F2A肽和T2A肽切除插入的外源基因和載體序列，因此，得到的iPS細(xì)胞不會(huì)留下外源基因組的“足跡”［14］，可更好地應(yīng)用于臨床。更重要的是利用piggyBac轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)染 Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc和 Lin28 5 種基因能使轉(zhuǎn)導(dǎo)率達(dá)到1%，相當(dāng)于以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)率［15］。

4 使用重組蛋白誘導(dǎo)iPS細(xì)胞

2009年 Zhou 等［16］將重組蛋白(Oct4-11R、Sox2-11R、Klf4-11R和c-Myc-11R)轉(zhuǎn)入小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，成功地誘導(dǎo)出類胚胎干細(xì)胞——蛋白誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(piPSC)。這一技術(shù)在誘導(dǎo)iPS細(xì)胞領(lǐng)域里產(chǎn)生了重大的突破，能在不涉及基因組調(diào)節(jié)的情況下，只憑借蛋白質(zhì)就能將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成iPS細(xì)胞，這一技術(shù)大大簡(jiǎn)化了將細(xì)胞重編程為類胚胎干細(xì)胞的常用技術(shù)的繁瑣步驟。Zhou的研究小組首先將Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc 4種基因重編程大腸桿菌細(xì)胞，促使大腸桿菌表達(dá)4種基因，形成的蛋白經(jīng)過正確折疊、修飾、純化和連接目標(biāo)肽，在目標(biāo)肽的引導(dǎo)下通過滲透法進(jìn)入小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，發(fā)揮誘導(dǎo)功能。實(shí)驗(yàn)證實(shí)只有通過反復(fù)多次的轉(zhuǎn)入重組蛋白，才可能誘導(dǎo)出類胚胎干細(xì)胞。這種方法與之前誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞的方法相比有以下2點(diǎn)優(yōu)勢(shì)［17］:(1)有效地消除了外源基因和序列對(duì)細(xì)胞基因的修改造成的風(fēng)險(xiǎn);(2)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法更加簡(jiǎn)單快速、經(jīng)濟(jì)實(shí)用。然而，缺點(diǎn)就是難以提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，在轉(zhuǎn)導(dǎo)4種重組蛋白及組蛋白脫乙?；敢种苿焖?valproic acid，VPA)(也能提高Oct4、Sox2、和Klf4 3種基因誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞重編程效率［18］)的作用下，僅能將5×104個(gè)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞成功改造得到3個(gè)iPS細(xì)胞。

5 結(jié)語

iPS細(xì)胞研究在短短幾年時(shí)間里已取得重大的突破，為避免重編程外源基因可能導(dǎo)致受體發(fā)生插入性腫瘤及影響細(xì)胞分化等潛在性危險(xiǎn)，應(yīng)盡量減少外源基因的整合。從2006年 Takahashi等轉(zhuǎn)導(dǎo)Oct4、Sox2、Klf4和 c-Myc等24種因子到如今 Kim等［19］只轉(zhuǎn)導(dǎo)Oct4一個(gè)基因就誘導(dǎo)得到iPS細(xì)胞，可見其研究進(jìn)展是迅速的?？茖W(xué)家首次誘導(dǎo)iPS細(xì)胞使用了逆轉(zhuǎn)錄病毒，出現(xiàn)了載體的序列整合到宿主細(xì)胞基因組，存在癌基因激活的危險(xiǎn)。因此，研究者又陸續(xù)研發(fā)了慢病毒、腺病毒、質(zhì)粒載體，重組蛋白轉(zhuǎn)染成體細(xì)胞誘導(dǎo)得到iPS細(xì)胞，大大減少了外源基因的整合，然而科學(xué)家在設(shè)計(jì)出更安全的載體后，又普遍出現(xiàn)了誘導(dǎo)效率低下的困惑，這嚴(yán)重影響了誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的臨床應(yīng)用及藥物開發(fā)。因此，iPS細(xì)胞領(lǐng)域的研究者都期待著在不轉(zhuǎn)導(dǎo)外來基因組的情況下，通過蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)或?qū)ふ腋m合的誘導(dǎo)細(xì)胞和載體技術(shù)，創(chuàng)造出更安全、更高效、更穩(wěn)定的 iPS細(xì)胞。

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