朱 翔 綜述 董 揚 審校

骨肉瘤分子邊界相關標記物的研究進展

朱 翔 綜述 董 揚 審校

骨肉瘤邊界包含著豐富的腫瘤病變的特征信息，對疾病的分類、臨床治療方案設定、疾病預后具有重要意義。分子生物學和基因組學研究的不斷深入，為骨肉瘤的分子邊界研究提供了理論基礎，并且為檢測分子邊界相關標志物提供了必要的技術手段，一些新的分子標記物也隨之被提出并研究。本文就目前相關領域的骨肉瘤分子邊界相關標記物進行綜述。

骨肉瘤 分子邊界 標記物

骨肉瘤是最常見的骨原發(fā)性惡性腫瘤，好發(fā)于青少年，惡性程度高，預后差，是嚴重影響青壯年健康的惡性腫瘤。目前，保肢手術是治療骨肉瘤的最主要手段之一，而術后局部復發(fā)是手術治療失敗和影響疾病預后的重要原因。因此，手術切緣徹底與否成為影響預后的主要因素，如何獲得安全的手術切緣目前仍存在較大爭議。傳統(tǒng)方法判斷手術切除是否干凈主要基于對切緣組織的常規(guī)病理學 （即細胞形態(tài)學）觀察，然而在病理學診斷為切緣陰性的患者中，仍有10%～30%出現(xiàn)了局部的復發(fā)[1]。常規(guī)病理學的局限性在于對形態(tài)上（或表型上）與正常細胞無可見差異的癌前細胞或具有潛在轉(zhuǎn)化能力的“正常”細胞沒有區(qū)分能力；當正常細胞中只有少量癌細胞或微癌灶只存在于切緣組織的某個區(qū)域時，極易造成漏檢。事實上，骨肉瘤在細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化之前，其分子水平及生化代謝水平已發(fā)生異常改變，出現(xiàn)功能異常的癌基因產(chǎn)物。分子生物學和基因組學研究的不斷深入，為骨肉瘤手術切緣的分子邊界研究提供了理論基礎，并且為探討分子邊界提供了必要的技術手段，一些新的分子標記物也隨之被提出并研究?，F(xiàn)將與骨肉瘤手術切緣相關的一些分子標記物及其研究現(xiàn)狀綜述如下。

1 p16基因

p16是一種新型抑癌基因，位于人類染色體9p16區(qū)，與細胞周期調(diào)節(jié)密切相關，該蛋白是CDK4的抑制因子，通過與細胞周期蛋白D1以競爭方式結(jié)合CDK4，抑制CDK4的活性，使細胞停滯于G0期和G1期，抑制細胞分裂增殖。CDK4可調(diào)節(jié)多種底物的磷酸化，是G1/S期和G2/M期轉(zhuǎn)換的關鍵。體外研究證實，p16蛋白能特異地抑制CDK4的活性。細胞周期蛋白D表現(xiàn)為某種癌基因的作用，當其過度表達時，細胞便會向癌細胞發(fā)展。細胞周期蛋白D同CDK4結(jié)合時，可刺激細胞生長分裂；p16與CDK4結(jié)合時，致使其磷酸化活性降低，引起Rb磷酸化而導致腫瘤細胞死亡。因此，p16既是細胞周期固有的調(diào)控者，又是抑制腫瘤生長的關鍵成分。

王海濤等[2]發(fā)現(xiàn)，骨軟骨瘤中 p16 mRNA的表達顯著高于骨肉瘤。這說明p16表達降低有可能使癌細胞獲得某種生長優(yōu)勢，預示這些患者預后不良。該研究同時檢測了骨肉瘤和肉瘤旁組織PTEN、p16、Rhoc等表達情況，分析癌瘤向周邊浸潤及周圍組織癌變趨向的規(guī)律。結(jié)果顯示，距原發(fā)病灶越遠，PTEN、p16、Rhoc陽性的比例逐漸降低，癌旁發(fā)生高危病變的幾率降低（P<0.05）。李文輝等[3]的實驗發(fā)現(xiàn)，p16在骨肉瘤組織中陽性率為36.67%，認為p16基因的缺失可導致p16蛋白定量、定位或結(jié)構(gòu)的改變，造成p16蛋白功能異常，從而導致抑癌功能失活。

2 Survivin基因

Survivin基因是新近分離鑒定的凋亡抑制蛋白（Inhibitorof apop tosis，IAP），在人類大多數(shù)腫瘤組織中高表達，而在正常成人組織中不表達，因其具有獨特的結(jié)構(gòu)和分布而區(qū)別于其他凋亡抑制基因[4]。Survivin編碼產(chǎn)生含142個氨基酸的蛋白，能直接抑制 Caspase蛋白酶活性而抑制細胞凋亡。Survivin是細胞周期G2/M期的重要調(diào)節(jié)因子，與其他細胞周期G2/M期檢測點的調(diào)控基因具有協(xié)同作用，以保證細胞復制的忠實性[5]。其過量表達可導致腫瘤細胞逃避細胞周期檢測點，從而使腫瘤細胞逃避凋亡，異常增殖，導致腫瘤的形成。

Survivin在絕大多數(shù)分化成熟的組織（除胎盤等）中不表達或低表達，而在胚胎組織以及大多數(shù)實體瘤組織中高表達。楊寶軍等[6]的實驗證明，Survivin表達于骨肉瘤細胞漿，少量可見細胞核表達，同時發(fā)現(xiàn)Survivin胞核表達在部分腫瘤中臨床意義高于細胞漿。Survivin在38例骨肉瘤標本中陽性率分別為44.7%（17/38）和55.3%（21/38）。Survivin的表達與患者年齡、性別、骨肉瘤亞型無明顯關系，但與Enneking外科分期有關，Ⅰ～ⅡA期與ⅡB～Ⅲ期之間的腫瘤Survivin表達率差異明顯（P＜0.05）。眾所周知，Enneking外科分期越高，患者預后越差，生存期越短。根據(jù)上述研究提示，Survivin可作為判斷患者預后的指標。

3 CRM1蛋白

CRM1蛋白是體內(nèi)一類重要的核輸出受體，CRM1蛋白參與細胞核-胞質(zhì)轉(zhuǎn)運，并在有絲分裂中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在細胞有絲分裂過程中，CRM1能和RAN2GTPase酶協(xié)同作用，調(diào)節(jié)有絲分裂中諸多重要環(huán)節(jié)，提示CRM1蛋白很可能參與了惡性腫瘤的病因?qū)W進程[7]。何忠惠等[8]研究檢測并分析了57例CRM1蛋白在骨肉瘤瘤組織和正常組織中的表達情況，發(fā)現(xiàn)CRM1在骨肉瘤組織中的表達較正常組織中明顯升高，伴有CRM1蛋白高表達的患者預后較差。該研究同時發(fā)現(xiàn)，CRM1的高表達和血清內(nèi)ALP的升高密切相關。

4 CD44

CD44是一種細胞表面黏附分子，主要參與細胞和細胞、細胞和基質(zhì)之間的特異性黏附過程，與細胞的運動、腫瘤的發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關。其基因按外顯子的表達方式不同可分為標準構(gòu)型CD44s（Standard form）和變異型 CD44v（Variant isoform）。應用基因分析手段檢測CD44基因在手術切緣處的變化情況，對于判斷術后效果、評估預后及確立手術切緣的分子邊界都具有重要的意義。

Femandez等[9]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織CD44s水平明顯高于腫瘤周邊黏膜組織，兩種組織的CD44s水平在高S期腫瘤中明顯高于低S期腫瘤。腫瘤組織CD44s水平和患者預后無關，然而腫瘤周邊非腫瘤黏膜的高CD44s水平和患者預后不良顯著相關。提示CD44可能在腫瘤生長中起一定作用，腫瘤周圍黏膜的CD44s水平可成為確立手術切緣分子邊界的標志物之一，且在評估腫瘤患者預后中發(fā)揮重要作用。李成存等[10]發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤組織中 CD44的陽性表達率顯著高于骨軟骨瘤及正常骨組織；其表達與骨肉瘤臨床分期、腫瘤轉(zhuǎn)移及2年內(nèi)死亡有關，而與患者性別、年齡、腫瘤大小、病理分型、術前化療無關；CD44陽性表達者與陰性表達者的腫瘤轉(zhuǎn)移率有顯著性差異。

5 MTA1基因

腫瘤轉(zhuǎn)移相關基因1（Metastasis associated 1，MTA1）是新近發(fā)現(xiàn)的一個腫瘤轉(zhuǎn)移相關基因，其表達與許多惡性腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移能力呈正相關。MTA1促進惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機制可能與組蛋白去乙?；D(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)有關。組蛋白末端乙?；苤泻徒M蛋白中的陽離子，從而降低DNA與乙?；瘏^(qū)域的結(jié)合，打開染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，促進轉(zhuǎn)錄；相反，組蛋白去乙?；谷旧|(zhì)結(jié)構(gòu)變得緊密，抑制轉(zhuǎn)錄。

李新志等[11]通過應用半定量RT-PCR檢測高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細胞株和低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細胞株中MTA1的表達水平，發(fā)現(xiàn)高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細胞株中MTA1的表達水平明顯高于低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細胞株，有統(tǒng)計學意義，表明 MTA1基因表達水平與骨肉瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移潛能相關。為了進一步證明MTA1促進骨肉瘤轉(zhuǎn)移的作用，該研究還通過真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MTA1基因到低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細胞株，使之能穩(wěn)定表達MTA1，可以檢測到低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細胞株在轉(zhuǎn)染后侵襲能力顯著性增加。步國強等[12]用免疫組化技術證實MTA1蛋白主要表達于細胞核和細胞漿，與Moon等[13]的報道一致。該研究認為MTA1的表達與患者的性別、年齡、發(fā)病部位、發(fā)病-就診時間及腫瘤的體積均無相關性。

6 端粒酶

端粒酶是一種核糖核蛋白體，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，它能以自身的RNA組分為模板合成端粒，以補償細胞分裂時染色體端粒的縮短，使得端粒的長度得以維持，從而逃避了因端?？s短而引起的細胞死亡，使細胞獲得“永生化”。正常人體細胞很少能檢測出端粒酶活性的表達，而100%的腫瘤細胞株及大多數(shù)腫瘤組織中的端粒酶活性卻有異常表達。端粒酶已被認為是迄今為止最有特異性和敏感性的腫瘤標志物和抗腫瘤治療的新靶點之一，因此檢測其活性和端粒的長度可用于估計癌變的潛能和趨勢、觀察療效及預后。

葉哲偉等[14]用原位分子雜交檢測骨肉瘤組織中各種細胞成分端粒酶hTERT的表達，結(jié)果顯示，端粒酶hTERT基因在骨質(zhì)增生骨組織、異位骨化組織和正常骨組織中的表達均為陰性。而52例骨肉瘤中，43例（82.17%）有端粒酶hTERT基因表達；在分布上，端粒酶hTERT陽性表達水平與腫瘤細胞的分布定位一致，hTERT均位于腫瘤細胞的胞質(zhì)中，這與hTERT的生化特征和功能是一致的。一方面說明原位分子雜交對于骨肉瘤細胞水平檢測端粒酶hTERT基因的定位診斷具有重要意義，另一方面說明在骨肉瘤的發(fā)展和維持中端粒酶可能起到重要的作用。

7 Rb2/p130基因

Rb2/p130基因是在1993年被發(fā)現(xiàn)并克隆成功的一個抑癌基因，屬Rb基因家族，它所表達的蛋白質(zhì) Rb2/p130通過維持細胞周期G0期細胞的轉(zhuǎn)錄靜止來促進細胞的分化與成熟，從而抑制細胞的惡變。它在人體內(nèi)的各種正常組織中具有廣泛的表達。Rb2/p130基因發(fā)生異?；蛉笔c多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。

李世德等[15]的實驗表明，骨肉瘤標本中Rb2/p130基因有一定程度的表達，但明顯低于骨軟骨瘤與正常骨組織，并且Enneking臨床分期越低的骨肉瘤標本中，Rb2/p130基因表達也越低，這些都說明了Rb2/p130基因作為抑癌基因在骨肉瘤中表達下降，從而失去維持G0期細胞的轉(zhuǎn)錄靜止及其對細胞周期的負性調(diào)控作用，使DNA合成增加，大量細胞進入S期，造成細胞異常增殖，導致腫瘤發(fā)生發(fā)展。Rb2/p130表達下降也使其促進細胞分化功能下降，使分化低的骨肉瘤細胞增多，是骨肉瘤發(fā)生發(fā)展、侵襲性強、預后不佳的重要原因之一，亦可作為骨肉瘤預后評價的參考指標之一。

綜上所述，骨肉瘤保肢手術治療的原則是徹底切除原發(fā)病灶，獲得陰性切緣。如何確立一個真正安全的手術切緣，對患者的局部復發(fā)和預后均起到了關鍵作用。常規(guī)病理學檢測出的癌細胞陽性切緣與切緣中僅有分子生物學變化者不同，后者僅有基因改變而無形態(tài)學改變，可能處于腫瘤發(fā)生的早期階段，這有可能成為腫瘤復發(fā)的根源。對手術患者切緣進行分子生物學檢測，確定其手術切緣的分子邊界，可對患者進行及時的干預，以提高其生存率。因此，常規(guī)的病理學檢查結(jié)合分子生物學檢測可提高手術切緣診斷的敏感性，對預防患者術后復發(fā)和評估預后都具有重要的意義。從分子水平重新評價和確定骨肉瘤的手術切緣，亟待深入探究。

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Advancement on Markers of Molecular Margins in Osteosarcoma

ZHU Xiang,DONG Yang.

Department of Orthopaedics,Shanghai Sixth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200233,China.

【Summary】The margins of osteosarcoma contain large amount of information about tumor lesions.The information is important to classify the characteristics of tumors,determine therapeutic plan and forecast prognosis of patients.The deepenings of recent advances in molecular biology and genomics not only provide theories for the research of molecular margins in osteosarcoma but also furnish necessary technical means for testing Molecular Margins.Some new molecular markers have been proposed and studied.The new Markers of molecular margins in osteosarcoma will be reviewed in this article.

Osteosarcoma;Molecular margins;Markers

Q813.1+2

A

1673-0364（2011）04-0181-05

2011年4月3日；

2011年4月26日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.05.001

200233 上海市 上海交通大學醫(yī)學院附屬第六人民醫(yī)院骨科。