朱柱 王春友

·綜述與講座·

胰腺癌干細(xì)胞研究進(jìn)展

朱柱 王春友

數(shù)十年來，胰腺癌長期生存率并無顯著改善，很大程度上歸咎于現(xiàn)有治療手段忽略了腫瘤的異質(zhì)性特征。大量研究表明[1-4]，腫瘤由少數(shù)腫瘤干細(xì)胞和大多數(shù)分化細(xì)胞組成，前者具有自我更新和分化能力并形成與維持腫瘤，而后者增殖潛能有限。自1997年Bonnet等[1]首先在人類急性粒細(xì)胞白血病中發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞以來，科學(xué)家們已相繼在乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌等[2-4]實(shí)體腫瘤中證實(shí)了腫瘤干細(xì)胞的存在，同時還發(fā)現(xiàn)其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等特征密切相關(guān)。由此可見，胰腺癌干細(xì)胞研究對于探討胰腺癌發(fā)病機(jī)制及指導(dǎo)臨床治療具有十分重要的意義。

一、胰腺癌干細(xì)胞的分離和鑒定

Li等[4]于2007年運(yùn)用免疫缺陷小鼠移植瘤模型和熒光激活細(xì)胞分選法(fluorescence activated cell sorting, FACS)從癌組織中首次分離并鑒定了表型為CD44+CD24+ESA+的胰腺癌干細(xì)胞。該亞群在胰腺癌組織中僅占0.2%～0.8%，但成瘤能力為非腫瘤干細(xì)胞(CD44-CD24-ESA-)的100倍，接種后形成的腫瘤與原發(fā)瘤組織學(xué)特征十分相似。此外，該亞群體內(nèi)連續(xù)傳代后仍能形成包含CD44+CD24+ESA+和CD44-CD24-ESA-表型的異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞，表明其具有自我更新和分化能力。隨后，Hermann等[5]應(yīng)用免疫磁珠細(xì)胞分選法(magnetic activated cell sorting, MACS)從癌組織中分離并鑒定了表型為CD133+的胰腺癌干細(xì)胞。該亞群約占胰腺癌組織的1.8%，具有極強(qiáng)的成瘤能力，表現(xiàn)為106個CD133-細(xì)胞接種后無法成瘤，而106個未分選細(xì)胞或僅500個CD133+細(xì)胞即可成瘤。體內(nèi)連續(xù)傳代后成瘤能力逐漸增強(qiáng)，而且可以產(chǎn)生CD133+和CD133-的異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞。

二、細(xì)胞系

Gou等[6]運(yùn)用球培養(yǎng)法富集胰腺癌PANC1細(xì)胞系中具有干細(xì)胞特性的亞群，發(fā)現(xiàn)該亞群能夠外排Hoechst 33342染料且連續(xù)傳代后產(chǎn)生能夠外排和無法外排該染料的子代細(xì)胞，高表達(dá)LY6E、TACSTD1、CD44等干細(xì)胞表面標(biāo)志分子。此外，該亞群成瘤能力較強(qiáng)，5×105個細(xì)胞和107個未富集細(xì)胞成瘤能力相當(dāng)。Hermann等[5]在胰腺癌L3.6pl細(xì)胞系中分選出占總體比例1%～2%的CD133+亞群，成瘤能力強(qiáng)，表現(xiàn)為103個CD133+即可成瘤，而106個CD133-細(xì)胞卻無法成瘤。該亞群能夠在無血清培養(yǎng)基中增殖產(chǎn)生相同表型的子細(xì)胞，而在含血清培養(yǎng)基中分化為成熟的腫瘤細(xì)胞，表明其具有干細(xì)胞特性。Zhou等[7]運(yùn)用FACS技術(shù)在PANC1細(xì)胞系中分選出占總體比例約3%的SP細(xì)胞，但未進(jìn)一步研究其自我更新和分化能力。而新近Kabashima等[8]也在PANC1、KP-1NL 和Capan-2等胰腺癌細(xì)胞系中分選出不同比例的SP細(xì)胞，具有自我更新和分化能力，表現(xiàn)為能夠產(chǎn)生SP和非SP亞群共存的子代細(xì)胞。Chambers等[9]應(yīng)用DNA標(biāo)記滯留技術(shù)在BxPC3和PANC03.27等胰腺癌細(xì)胞系中分選出具有干細(xì)胞特性的DiI+慢周期細(xì)胞亞群(DiI+/SCC)。該亞群不同程度表達(dá)CD24、CD44、CD133和ALDH，成瘤能力為DiI-快周期細(xì)胞亞群(DiI-/FCC)的10倍。

三、胰腺癌干細(xì)胞與侵襲轉(zhuǎn)移

早期侵襲轉(zhuǎn)移(即局部進(jìn)展和全身擴(kuò)散)是胰腺癌生物學(xué)行為的一個重要特征，導(dǎo)致超過75%的胰腺癌患者就診時就失去了根治性手術(shù)的機(jī)會。經(jīng)典的侵襲轉(zhuǎn)移理論認(rèn)為，這是一個連續(xù)的包含多個步驟的過程，需要腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)瘤并滲入血液或淋巴循環(huán)，體內(nèi)遷徙后黏附到其他部位進(jìn)而形成微轉(zhuǎn)移灶和血供，最終形成肉眼可見的轉(zhuǎn)移灶[9-10]。盡管如此，轉(zhuǎn)移實(shí)際上是一個極為低效的過程，意味著只有極少一部分腫瘤細(xì)胞能夠最終形成肉眼可見的轉(zhuǎn)移灶[11]。Luzzi等[12]研究發(fā)現(xiàn)，2%腫瘤細(xì)胞能夠形成微轉(zhuǎn)移灶，但僅0.02%能夠最終形成肉眼可見的轉(zhuǎn)移灶。Dembinski等[13]運(yùn)用Transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在BxPC3和PANC03.27細(xì)胞系中DiI+/SCC的穿膜細(xì)胞數(shù)分別是DiI-/FCC 的4和4.5倍，表明具有腫瘤干細(xì)胞特性的DiI+/SCC亞群侵襲能力更加顯著。Kabashima等[8]應(yīng)用肝轉(zhuǎn)移模型發(fā)現(xiàn)在KP-1NL細(xì)胞系中103個SP細(xì)胞接種后可發(fā)生轉(zhuǎn)移，而5×103個非SP細(xì)胞接種后卻無法發(fā)生，表明具有腫瘤干細(xì)胞特性的SP細(xì)胞具有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力。

近年來大量研究表明，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transformation, EMT)在多種上皮來源的惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[14-16]，EMT與腫瘤干細(xì)胞的關(guān)系也愈來愈受到關(guān)注。Kabashima等[8]發(fā)現(xiàn)，TGF-β調(diào)控的EMT過程主要發(fā)生在PANC1和KP-1NL細(xì)胞系中的SP細(xì)胞中。Dembinski等[13]亦發(fā)現(xiàn)，BxPC3及PANC03.27細(xì)胞系中DiI+/SCC較DiI-/FCC EMT相關(guān)分子snail和E-Cadherin表達(dá)降低，而twist、vimentin和N-Cadherin表達(dá)升高，表明EMT過程主要發(fā)生于DiI+/SCC中，說明腫瘤干細(xì)胞更容易發(fā)生EMT。

“種子與土壤”與“歸巢”學(xué)說是器官特異性腫瘤轉(zhuǎn)移兩大經(jīng)典理論，其分子機(jī)制以基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1/趨化因子受體軸(SDF-1/CXCR4 axis)研究較為深入[17-20]。SDF-1生物學(xué)效應(yīng)主要包括誘導(dǎo)表達(dá)CXCR4細(xì)胞的趨化反應(yīng)和黏附作用，促進(jìn)金屬基質(zhì)蛋白酶(MMPs)和血管形成因子的分泌，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和侵襲。Hermann等[5]從L3.6pl細(xì)胞系中分選出CD133+CXCR4+和CD133+CXCR4-兩個亞群后發(fā)現(xiàn)兩者成瘤能力沒有差異，但僅前者能夠發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，且應(yīng)用CXCR4抑制劑AMD3100后可以顯著減少腫瘤轉(zhuǎn)移。此外來源于患者癌組織的CD133+亞群CXCR4表達(dá)率高者侵襲能力強(qiáng)，腫瘤患者臨床分期晚。該研究首次提出“轉(zhuǎn)移性腫瘤干細(xì)胞”概念，表明其遷移，特別是器官特異性轉(zhuǎn)移主要通過激活CXCR4實(shí)現(xiàn)，從新的角度闡釋了SDF/CXCR4軸在胰腺癌肝轉(zhuǎn)移中的作用。

四、胰腺癌干細(xì)胞與放化療抵抗

放化療抵抗是腫瘤干細(xì)胞基本特征之一，原因包括凋亡和DNA損傷抵抗等。多項(xiàng)研究表明，胰腺癌干細(xì)胞很可能也對放化療抵抗。Shah等[21]從L3.6pl和AsPC-1細(xì)胞系中篩選出吉西他濱抵抗的胰腺癌細(xì)胞株，形態(tài)和功能上都發(fā)生了EMT，且干細(xì)胞標(biāo)志CD44、CD24和ESA表達(dá)均顯著增加。Lee等[22]發(fā)現(xiàn)放化療能夠富集來源于癌組織的CD44+CD24+ESA+亞群。Hermann等[5]也發(fā)現(xiàn)L3.6pl細(xì)胞系和癌組織中CD133+亞群較CD133-亞群耐藥更加顯著，且延長化療后前者出現(xiàn)富集現(xiàn)象。同樣，Dembinski等[13]發(fā)現(xiàn)5-FU和吉西他濱標(biāo)準(zhǔn)治療后存活的DiI+/SCC在撤去化療藥物后繼續(xù)分裂增殖為包含DiI+/SCC和DiI-/FCC的異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞。此外， 在成體干細(xì)胞和腫瘤中都過度表達(dá)的ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白(ATP-binding cassette proteins, ABCG)可以介導(dǎo)藥物外排進(jìn)而導(dǎo)致多藥耐藥和SP表型的出現(xiàn)，在腫瘤干細(xì)胞的化療抵抗中發(fā)揮重要作用[23]。Zhou等[7]發(fā)現(xiàn)FACS分選PANC1細(xì)胞系后得到的SP細(xì)胞中ABCG1與ABCG2的表達(dá)水平為非SP細(xì)胞的20余倍，進(jìn)一步證實(shí)了上述觀點(diǎn)。

五、胰腺癌干細(xì)胞相關(guān)信號通路與靶向治療

新近研究證實(shí)，胰腺癌干細(xì)胞中多種信號通路表達(dá)與調(diào)控異常，包括SHH、Bmi-1、TGF-β、EGFR等[4,13,22]。Li等[4]發(fā)現(xiàn)SHH在胰腺癌細(xì)胞、CD44-CD24-ESA-和CD44+CD24+ESA+亞群中的表達(dá)水平依次是正常胰腺上皮細(xì)胞的4.1、4.0和40.6倍。與此同時，Lee等[22]也發(fā)現(xiàn)Bmi-1在正常胰腺上皮細(xì)胞和CD44-CD24-ESA-亞群中的表達(dá)沒有差異，而在CD44+CD24+ESA+亞群中的表達(dá)約為正常胰腺上皮細(xì)胞的7倍。此外，Dembinski等[13]觀察到與未分選胰腺癌細(xì)胞系相比，DiI+/SCC亞群中TGF-β1表達(dá)上調(diào)，而EGFR則與之相反。因此，針對胰腺癌干細(xì)胞中異常表達(dá)與調(diào)控的信號通路進(jìn)行靶向治療具有十分重大的意義。Mueller等[24]聯(lián)合應(yīng)用SHH抑制劑環(huán)王巴明、mTOR阻斷劑雷帕霉素和吉西他濱化療使胰腺癌體內(nèi)與體外模型中的腫瘤干細(xì)胞減少至無法檢測的水平，表明傳統(tǒng)化療配合腫瘤干細(xì)胞靶向治療極有可能徹底改變胰腺癌患者的預(yù)后。

六、問題與展望

胰腺癌干細(xì)胞理論從新的角度闡述了胰腺癌的發(fā)病機(jī)制，為臨床治療提供了新的突破口。胰腺癌干細(xì)胞表面標(biāo)志包括CD44、CD24、ESA、CD133和CXCR4，功能標(biāo)志包括SP與DiI。這些標(biāo)志物的產(chǎn)生與干細(xì)胞的譜系發(fā)育過程及其生物學(xué)行為之間的關(guān)系尚不明確。應(yīng)用轉(zhuǎn)基因及敲基因工程小鼠建立胰腺癌模型，分析不同時期相關(guān)標(biāo)志的表達(dá)，有利于明確腫瘤干細(xì)胞的動態(tài)演變和生物學(xué)行為的關(guān)系。腫瘤干細(xì)胞與非腫瘤干細(xì)胞或正常干細(xì)胞在基因和蛋白表達(dá)譜及相關(guān)信號通路表達(dá)和調(diào)控有何差異還有待進(jìn)一步研究。倘若我們能夠發(fā)現(xiàn)特異性的標(biāo)志分子或者信號通路，將有助于開發(fā)有效的早期檢測方法、精準(zhǔn)的靶向治療藥物以及科學(xué)合理監(jiān)測復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的手段。此外，明確SP細(xì)胞在胰腺癌耐藥中發(fā)揮的作用，將為未來抗癌藥物的開發(fā)與藥效評價提供堅實(shí)的理論基礎(chǔ)。

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2010-01-11)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.01.027

430022 湖北武漢，華中科技大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院胰腺外科中心

王春友，Email: chunyouwang52@126.com