張鯤鵬，鄒泓

（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子832002）

腎癌透明細(xì)胞癌（Renal Cell Carcinoma）是起源于腎上皮細(xì)胞的惡性腫瘤。占全部腎臟腫瘤的85%以上[1]。在世界范圍內(nèi)，腎癌的死亡病例每年超過10萬例，腎癌對放射治療、化學(xué)治療和激素治療均不敏感[2]，但其免疫原性極強(qiáng)，因此腎癌的免疫治療一直是研究的熱點(diǎn)。而制約腎癌免疫治療研究的一大障礙是缺乏與人體免疫環(huán)境近似的實(shí)驗(yàn)動物模型。應(yīng)用動物模型可以縮短研究時(shí)間，便于觀察并干預(yù)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的全過程，對于研究腫瘤的病理變化、發(fā)生發(fā)展機(jī)制、治療及預(yù)防有重要意義。

轉(zhuǎn)移瘤模型是最常用的一種實(shí)驗(yàn)動物模型，具有操作簡單、成瘤率高、成瘤時(shí)間相對可以控制等優(yōu)點(diǎn)。但轉(zhuǎn)移瘤模型成瘤條件尚不統(tǒng)一，其中差別最大的就是成瘤細(xì)胞濃度，目前國內(nèi)外學(xué)者最常用成瘤濃度之間濃度相差10 倍，探討最佳的成瘤濃度，為保證裸鼠在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到成瘤要求是有意義的。本研究選擇BALB/C 品系制作腎透明細(xì)胞癌裸鼠模型，注射部位選擇血運(yùn)豐富的前肢腋下，重點(diǎn)探討最佳成瘤細(xì)胞濃度。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑和耗材

1640、MEM 培養(yǎng)基（美國Invitrogen 公司）；胰蛋白酶含0.25%EDTA 消化液（北京索萊寶公司）；PBS（上海生工公司）；胎牛血清（以色列Biolnd 公司）；15ml 離心管（美國Corning 公司）；凍存管（美國Corning 公司）；0.22 μm 一次性針頭式濾器（美國Millipore 公司）；1000、200、10 μL 無酶槍頭（上海生工公司）；雌性BALB/c-nu 裸鼠 （北京中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所）。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

SW-CJ-1F 型超凈臺（蘇州博訊公司）；371 型CO2培養(yǎng)箱（美國ThermoFisher 公司）；IX71 型倒置熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）；TDL-50B 型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；移液器（德國Eppendorf 公司）；高壓蒸汽滅菌鍋（日本SANYO 公司）；1810-B型石英自動雙重純水蒸餾器（江蘇丹陽門石英玻璃廠）；HHW-21 型水浴箱（北京光明醫(yī)療儀器廠）；BCD-539WT 型冰箱（海爾公司）；AB204-E 型電子天平（美國MonoBloc 公司）；CO2恒溫培養(yǎng)箱 （美國Thermo Forma）

1.1.3 實(shí)驗(yàn)材料及條件

人腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞株（786-0）和人腎透明細(xì)胞癌胸水轉(zhuǎn)移細(xì)胞株（ACHN，與786-0 屬同源細(xì)胞系），購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫（上海），單層貼壁細(xì)胞，含10%FBS（胎牛血清，F(xiàn)etal bovine serum）的1640（786-0）和MEM（ACHN）培養(yǎng)基培養(yǎng)于CO2恒溫孵育箱中（37 ℃，CO2濃度為5%）。細(xì)胞在培養(yǎng)過程嚴(yán)格規(guī)培操作，無支原體、細(xì)菌、真菌等污染。4-6 周齡雌性BALB/c-nu 裸鼠48只（786-0 和ACHN 細(xì)胞株各4 組，每組6 只），體重16-17 g，由北京中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所提供，由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物研究院代養(yǎng)，飼養(yǎng)于SPF 級（Specific pathogen Free，SPF，無特定病原體）環(huán)境中，高壓滅菌的標(biāo)準(zhǔn)飼料和水喂養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞懸液配制

選擇786-0 細(xì)胞株和ACHN 細(xì)胞株在37 ℃、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并連續(xù)傳代（傳代20代以內(nèi)），當(dāng)細(xì)胞生長成致密單層，融合度達(dá)到80%～90%且狀態(tài)良好為注射標(biāo)準(zhǔn)，傳代（第12 代）到需要的細(xì)胞量，每次傳代均在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，保證細(xì)胞在對數(shù)生長期傳代。消化細(xì)胞：胰酶消化1 min，含血清培養(yǎng)基終止消化，轉(zhuǎn)入離心管中離心（1000 r/min 離心5 min），去上清液，加無血清培養(yǎng)基混勻，轉(zhuǎn)移到離心管中備用。細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)：取990 微升培養(yǎng)基+10 微升細(xì)胞懸液混勻，根據(jù)公式總細(xì)胞數(shù)= 計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)/4×100×104，連續(xù)計(jì)數(shù)3 次，取平均值，根據(jù)濃度梯度1×106、3×106、5×106、10×106，計(jì)算需要細(xì)胞懸液量，配制200 μL/注射點(diǎn)（每只注射0.2 mL），濃度分別為1×106/200 μL（A 組）、3×106/200 μL（B 組）、5×106/200 μL（C 組）、10×106/200 μL（D 組）。

1.2.2 成瘤實(shí)驗(yàn)及病理學(xué)觀察

將48 只裸鼠隨機(jī)分成8 組，按照設(shè)計(jì)濃度梯度分別注射786-0 細(xì)胞株與ACHN 細(xì)胞株懸液，為避免混淆裸鼠分籠喂養(yǎng)并標(biāo)記。接種前測量裸鼠體重，此后每周稱量體重；從開始觀察到注射部位形成硬結(jié)開始，每周用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長短徑，根據(jù)公式體積=長×短2/2，直到最小腫瘤達(dá)1 cm，處死裸鼠，剝離腫瘤，記錄腫瘤大小和重量，查看其它組織器官是否有轉(zhuǎn)移瘤。切開腫瘤肉眼觀察記錄，制作HE 切片，顯微鏡下觀察腫瘤的形態(tài)及壞死狀況。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±S）表示，應(yīng)用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理分析，組間比較用單因素方差分析；P＜0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理前裸鼠狀況

人腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞株（786-0）和人腎細(xì)胞癌胸水轉(zhuǎn)移細(xì)胞株（ACHN）細(xì)胞生長成致密單層，融合度基本達(dá)到80-90%，細(xì)胞飽滿，呈對數(shù)生長，且狀態(tài)良好，均達(dá)到注射的標(biāo)準(zhǔn)，注射前為第12 代。裸鼠整體身體良好，活動良好，無弓背過瘦，稱重平均17 g，符合4-6 周齡裸鼠體重，裸鼠均無毛，皮膚淺紅，飲食正常。

2.2 成瘤過程觀察記錄

裸鼠SPF 級環(huán)境飼養(yǎng)，于前肢腋下注射腫瘤細(xì)胞后觀察：第一周注射點(diǎn)基本無明顯變化；從第二周開始（約第10 天開始），出現(xiàn)小結(jié)節(jié)狀腫塊，觸之較硬，記錄腫瘤長短徑；第三周除A 組外，B、C、D 組裸鼠均成瘤，腫瘤大小隨注射腫瘤細(xì)胞濃度增加而增大，腫瘤呈結(jié)節(jié)狀，表面皮膚呈淺黃色。腫瘤較小，不影響裸鼠活動，尚未見惡病質(zhì)等癥狀，記錄腫瘤大?。坏谒闹軙r(shí)，D 組裸鼠腫瘤最大，腫瘤表皮有明顯破潰點(diǎn)，B、C 組裸鼠成瘤均稍小于D 組，A 組未成瘤。

根據(jù)記錄的腫瘤大?。ū?）繪制裸鼠腫瘤生長曲線（圖1）。裸鼠體重記錄顯示：裸鼠體重增加情況相近，每周增加約1 g，保證所有裸鼠接近于正常生長，與人類腎癌患者的早期臨床表現(xiàn)相接近。

表1 裸鼠腫瘤體積 S，n=6Tab.1 Tumor volume in nude mice S，n=6

生長曲線（圖1） 顯示：B 組和C 組裸鼠腫瘤生長速度和大小基本相近，即注射后一個(gè)月成瘤約1 cm3，而D 組10×106/ 點(diǎn)裸鼠腫瘤生長較快，注射后三周成瘤約1 cm3，第四周腫瘤接近1.4 cm3，且均有破潰點(diǎn)，已不利于檢測，屬惡病質(zhì)前期。

圖1 裸鼠腫瘤生長曲線Fig.1 Tumor growth curve in nude mice

2.3 瘤體取材，制作切片HE 染色，鏡下觀察

第四周采用高濃度二氧化碳處死裸鼠，剝離腫瘤，沿最大面切開，肉眼可見：B 組（圖2A、2E）腫瘤切面灰黃，基本未見明顯壞死，C 組（圖2B、2F）腫瘤切面灰黃色，囊實(shí)性，囊樣結(jié)構(gòu)內(nèi)可見灰黃色液狀壞死物，D 組（圖2C、2G）腫瘤切面大部分為囊性，囊內(nèi)見多量液狀壞死物，實(shí)性部分少。

常規(guī)制作HE 切片，鏡下觀察：786-0（圖2D）與ACHN（圖2H）細(xì)胞成瘤后，細(xì)胞卵圓形、梭形，胞漿透亮，與腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞相似，說明保留了原發(fā)腫瘤的形態(tài)特點(diǎn)。各組比較，B 組腫瘤細(xì)胞實(shí)性片狀，細(xì)胞卵圓形、梭形，胞漿透亮，壞死稀少，C 組腫瘤細(xì)胞形態(tài)與B 組相似，但腫瘤組織中央可見液化性壞死區(qū)，D 組鏡下腫瘤大部分區(qū)壞死，存活細(xì)胞少，顯示腫瘤鏡下形態(tài)與肉眼觀察結(jié)果一致。

圖2 裸鼠剝離腫瘤切片HE 染色Fig.2 HE staining of dissected tumor sections in nude mice

3 討論

裸鼠成為腫瘤模型的工具是因?yàn)槠湫叵偃狈Γ?xì)胞免疫功能缺如，免疫排斥反應(yīng)低下，在一定程度上模擬了人類患者免疫機(jī)制紊亂而導(dǎo)致的腫瘤失控性生長。自1969年Rygaard 首次成功的將人結(jié)腸癌移植到裸鼠體內(nèi)開始，裸鼠成瘤就被廣泛的用于基礎(chǔ)和臨床研究。目前國內(nèi)外常用的動物模型有四種類型：自發(fā)瘤模型、誘導(dǎo)模型、移植模型、轉(zhuǎn)基因動物模型。轉(zhuǎn)移瘤模型有操作簡單、成瘤率高、成瘤時(shí)間相對可以控制等優(yōu)點(diǎn)，而且制作轉(zhuǎn)移瘤可操作性強(qiáng)，降低個(gè)體差異對腫瘤生長的影響，故轉(zhuǎn)移裸鼠模型廣泛應(yīng)用[3-13]。

腎癌786-0 細(xì)胞株來自于原位腫瘤分離，腎癌ACHN 源自人腎細(xì)胞癌胸水轉(zhuǎn)移分離，其惡性程度均較高，均具有較高的成瘤性。通過文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)成瘤裸鼠模型中成瘤濃度各家報(bào)道不一，差距較大，Teruo[14]、Kristy[1]等 采用1×106每 個(gè) 點(diǎn)，Zhang[9]等 采用10×106每個(gè)點(diǎn)，最小與最大有十倍之差，故我們探索其最佳成瘤濃度；有報(bào)道稱10×106/200 μL 皮下成瘤，21 d 均可出現(xiàn)皮下結(jié)節(jié)。Sharkey[15]報(bào)道，腎癌細(xì)胞株裸鼠平均成瘤率為50%。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：成瘤率在3×106～10×106隨濃度增加而增加，當(dāng)濃度大于3×106時(shí)，裸鼠皮下成瘤率為100%，而濃度為1×106時(shí)，裸鼠不成瘤，可見上述報(bào)道不成瘤原因可能是接種細(xì)胞濃度低所致。Ciardiello[16]等接種ACHN 細(xì)胞株10×106/200 μL 于裸鼠皮下，腫瘤在1 周時(shí)長至1 cm3。本實(shí)驗(yàn)同等細(xì)胞量組成瘤率與之相符，而成瘤大小稍慢，第2 周長至1 cm3，可能與細(xì)胞反復(fù)凍融和多次傳代導(dǎo)致細(xì)胞生物學(xué)特性改變和成瘤率下降有關(guān)。Wang[17]報(bào)道，腎癌ACHN 細(xì)胞株裸鼠移植瘤部位在腋下成瘤率高，接種腫瘤細(xì)胞在傳代20 代以內(nèi)成瘤率高，故本實(shí)驗(yàn)選用前肢腋下成瘤，接種腫瘤細(xì)胞為第12 代，以保證本實(shí)驗(yàn)不受接種部位和細(xì)胞代數(shù)的影響。研究發(fā)現(xiàn)裸鼠皮下移植瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移少[18]或者較晚[19]。本實(shí)驗(yàn)亦未發(fā)現(xiàn)有明顯的轉(zhuǎn)移。有報(bào)道采用尾靜脈注射瘤細(xì)胞建立腎癌轉(zhuǎn)移模型，Wang[17]報(bào)道，尾靜脈注射轉(zhuǎn)移率100%，其中肺轉(zhuǎn)移多見，轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞形態(tài)與腎癌細(xì)胞吻合。腎癌主要通過血道轉(zhuǎn)移，故皮下注射成瘤的轉(zhuǎn)移比直接尾靜脈注射轉(zhuǎn)移晚，應(yīng)用尾靜脈注射法，腫瘤細(xì)胞可以通過血液循環(huán)直接到達(dá)容易轉(zhuǎn)移的靶器官，比皮下成瘤轉(zhuǎn)移更快，故采用皮下注射更易操作，實(shí)體瘤實(shí)驗(yàn)更合適，尾靜脈注射法由于直接入血，更適合于建立轉(zhuǎn)移模型，這就為腎癌轉(zhuǎn)移模型指引了方向。

通過本次研究發(fā)現(xiàn)，在控制細(xì)胞代數(shù)、接種部位前提下，腎透明細(xì)胞癌成瘤裸鼠最佳成瘤細(xì)胞濃度為3×106/ 點(diǎn)（786-0 和ACHN 相同），腫瘤細(xì)胞注射濃度在3×106-10×106范圍內(nèi)，隨著細(xì)胞注射濃度的增加，腫瘤生長越快。我們較為成功的完善了人腎癌（786-0、ACHN）細(xì)胞裸鼠移植瘤模型。在接下來的工作中，我們將以此為基礎(chǔ)，結(jié)合相關(guān)研究進(jìn)展，開展臨床新鮮腫瘤組織樣本制作裸鼠成瘤模型，不斷積累裸鼠成瘤的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。