田璽擇 張萬(wàn)江

1989年,美國(guó)科學(xué)家 Capecchi[1]通過(guò)研究胚胎干細(xì)胞同源重組原理獲得的基因敲除小鼠取得成功,因此,Capecchi與美國(guó)科學(xué)家Smithies、英國(guó)科學(xué)家 Evans共同分享了2007年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng),成為基因敲除研究史上的又一里程碑。經(jīng)過(guò)20多年的不斷發(fā)展,基因敲除技術(shù)(gene knock-out)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的各個(gè)研究領(lǐng)域,尤其在結(jié)核病研究中取得了很大進(jìn)展,基因敲除技術(shù)已成為研究結(jié)核病發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的重要技術(shù)手段。筆者綜述了基因敲除技術(shù)的原理及其在結(jié)核病研究中的應(yīng)用。

基因敲除的原理、打靶載體的構(gòu)建及其篩選策略

一、基因敲除的原理

基因敲除技術(shù)是建立在同源重組(homologous recombination)和胚胎干細(xì)胞(embryo stem cells,ESC)基礎(chǔ)之上的一種新興生物技術(shù),也是研究基因功能的一種重要方法。首先要在體外構(gòu)建攜帶突變基因的打靶載體,然后將其導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞或體細(xì)胞中,利用基因的同源重組原理,用外源基因序列置換靶基因上的特定序列,通過(guò)研究靶基因與外源基因序列整合前后遺傳性狀的改變來(lái)研究靶基因的功能[2]。

由于傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)所得到的基因突變存在于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生殖細(xì)胞中,常出現(xiàn)因發(fā)育障礙而早期致死的現(xiàn)象,而條件性基因敲除技術(shù)可以將靶基因的修飾限制于特定的細(xì)胞或個(gè)體某一特定的發(fā)育階段,從而解決了這一難題。自1994年Gu等[3]利用Cre/LoxP重組酶系統(tǒng)研制組織特異性基因敲除小鼠獲得成功以來(lái),條件基因敲除技術(shù)已被廣泛應(yīng)用。條件性基因敲除(conditional gene knock-out)就是在基因敲除的基礎(chǔ)上,利用重組酶Cre介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性重組技術(shù),使得對(duì)小鼠基因組修飾的時(shí)間和范圍處于一種可控狀態(tài)。Cre重組酶可特異性識(shí)別loxP核酸序列,將loxP序列之間的目的基因切除,在特定階段、特定細(xì)胞中表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠可以通過(guò)與在基因組中引入 LoxP序列的小鼠交配,使子代小鼠的特定細(xì)胞中的靶基因被刪除,從而得到了組織特異性Cre轉(zhuǎn)基因小鼠[4-5]。

二、基因打靶載體的構(gòu)建策略

研究者可根據(jù)研究的需要選擇相應(yīng)的載體類型,通常選用的打靶載體有插入型載體和置換型載體。插入型載體的同源序列與靶基因組特定位點(diǎn)發(fā)生同源重組后,整個(gè)載體整合到了靶基因組的特定位點(diǎn)上,而置換型載體的同源序列與靶基因特定位點(diǎn)發(fā)生同源重組后,載體的同源序列取代了靶基因組上的特定序列。

后來(lái)又出現(xiàn)了2種新的打靶載體構(gòu)建策略,1991年Hasty等[6]提出了“hit and run”打靶策略,1993年 Askew等[7]提出了“tag and exchange”打靶策略。

三、基因打靶的篩選策略

由于大多數(shù)細(xì)胞難以發(fā)生同源重組介導(dǎo)的基因敲除,因而基因敲除成功的幾率很低。因此,要在基因打靶載體上添加正選擇標(biāo)記基因及負(fù)選擇標(biāo)記基因。正選擇標(biāo)記基因有2個(gè)功能,一是作為選擇標(biāo)記從轉(zhuǎn)染細(xì)胞中分離整合了外源基因的細(xì)胞;二是作為突變體置換或插入靶基因的編碼外顯子,使靶基因產(chǎn)生突變。負(fù)選擇標(biāo)記基因的功能主要是對(duì)抗打靶過(guò)程中產(chǎn)生的非同源重組,起富集中靶克隆的作用[8]。通常選用的篩選策略有正負(fù)向篩選法(positive and negative selection,PNS)和PCR篩選策略。

正負(fù)向篩選法是指將正選擇基因neo插入到打靶載體同源區(qū)內(nèi)的目的片段中,負(fù)選擇基因HSV-tk則插入到目的片段的外側(cè)。neo基因的插入既可形成基因突變,又是正向標(biāo)記。而負(fù)選擇基因 HSV-tk對(duì)更昔洛韋(Ganciclovir,GANC)敏感,因此含有HSV-tk的重組細(xì)胞可在GANC培養(yǎng)基中被殺死[9]。

PCR篩選法就是在構(gòu)建好的打靶載體上插入一段特定的核酸序列,通過(guò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小來(lái)鑒別插入突變和同源重組。

基因敲除在結(jié)核病研究中的應(yīng)用

一、基因敲除在結(jié)核分枝桿菌對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡作用研究中的應(yīng)用

利用基因敲除技術(shù)來(lái)研究結(jié)核分枝桿菌與宿主巨噬細(xì)胞(macrophage)之間的相互作用,對(duì)于揭示結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制具有重要的科學(xué)意義。被感染的巨噬細(xì)胞在病原體入侵后產(chǎn)生凋亡小體(apoptotic body)的能力是一種古老的先天免疫防御機(jī)制。對(duì)類似結(jié)核分枝桿菌一樣在細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期存在的病原體來(lái)說(shuō),抑制巨噬細(xì)胞凋亡對(duì)于其侵入性是非常重要的。

編碼Ⅰ型NADH脫氫酶nuoG亞基的結(jié)核分枝桿菌nuoG基因,對(duì)結(jié)核分枝桿菌介導(dǎo)的抑制宿主巨噬細(xì)胞凋亡有重要意義。Miller等[10]利用基因敲除技術(shù)得到的結(jié)核分枝桿菌nuoG缺失株來(lái)研究結(jié)核分枝桿菌nuoG缺失株與巨噬細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系,證實(shí)用半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-8及 TNF-α中和抗體來(lái)處理含有結(jié)核分枝桿菌nuoG缺失株的人巨噬細(xì)胞后,結(jié)核分枝桿菌nuoG缺失株的凋亡性表型有明顯降低。有趣的是,不僅nuoG敲除引起的凋亡可以使伴有活性氧拮抗劑的巨噬細(xì)胞潛伏期縮短,而且nuoG引起巨噬細(xì)胞分泌TNF-α能力的提高也能達(dá)到同樣的作用。這表明結(jié)核分枝桿菌通過(guò)nuoG依賴機(jī)制來(lái)抵抗活性氧的損害,以此來(lái)阻止TNF-α介導(dǎo)的宿主細(xì)胞凋亡,從而逃避巨噬細(xì)胞的殺傷。

巨噬細(xì)胞是結(jié)核分枝桿菌感染的天然微環(huán)境,為了抵抗氧化及亞硝基化,并在巨噬細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)久存活,結(jié)核分枝桿菌具備一種非常有效的抗氧化復(fù)合體系。在這些抗氧化劑酶當(dāng)中,TpX是結(jié)核分枝桿菌中惟一與硫醇過(guò)氧化物酶有同源序列的蛋白,曾有研究者報(bào)道體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌 TpX蛋白的功能與體外過(guò)氧化物酶的功能相似,為了研究tpx基因?qū)w內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的存活所起的作用,Hu等[11]通過(guò)基因敲除技術(shù)構(gòu)建了結(jié)核分枝桿菌tpx缺失突變株,結(jié)果顯示該突變株不能在巨噬細(xì)胞中生長(zhǎng)和存活,這說(shuō)明tpx對(duì)于結(jié)核分枝桿菌抵抗氧化及亞硝基化是必需的。

二、基因敲除在結(jié)核疫苗研究中的應(yīng)用

卡介苗作為預(yù)防結(jié)核病的接種疫苗,具有廣泛使用的安全性和免疫佐劑作用。ERP基因是既存在于有毒結(jié)核分枝桿菌又存在于卡介苗中的一個(gè)毒力基因,敲除卡介苗中的ERP基因有可能提高卡介苗對(duì)免疫缺陷患者使用的安全性。因此,利用基因敲除技術(shù)對(duì)卡介苗進(jìn)行改進(jìn)是開(kāi)發(fā)新疫苗的一種有益嘗試。

吳芳等[12]利用基因敲除技術(shù)擴(kuò)增ERP基因兩側(cè)序列,連接載體與目的片段,成功構(gòu)建了卡介苗ERP基因的置換型打靶載體,為進(jìn)一步構(gòu)建敲除ERP基因的卡介苗突變株及研究新型結(jié)核疫苗奠定了基礎(chǔ)。

編碼Bruton酪氨酸激酶的btk基因突變可導(dǎo)致伴X染色體(X-linked immune deficiency,XID)的免疫缺陷,該免疫缺陷常伴有B淋巴細(xì)胞為主要表型的功能損害。Kondratieva等[13]在前期研究中證明CBA/N-xid小鼠和野生型CBA小鼠不同,在感染結(jié)核時(shí)不受卡介苗的保護(hù)。在T細(xì)胞反應(yīng)性干擾素γ(IFN-γ-producing T-cells)和活化的巨噬細(xì)胞作為抗結(jié)核的關(guān)鍵因素后,仍然不清楚基因突變是為何主要影響沿T細(xì)胞-巨噬細(xì)胞反應(yīng)軸的B細(xì)胞功能。因此,Tatiana等[13]利用基因敲除和繼承性細(xì)胞遷移的方法來(lái)論證說(shuō)明先前未受重視的B細(xì)胞抑制中性粒細(xì)胞趨化作用的能力。證明B細(xì)胞缺陷會(huì)導(dǎo)致中性粒細(xì)胞異?？焖俚南蛲饨绱碳の镞w移。在這項(xiàng)研究中,利用中性粒細(xì)胞代替巨噬細(xì)胞的方法可大量減少T細(xì)胞反應(yīng)性干擾素γ和損傷的卡介苗,從而使一種更先進(jìn)的卡介苗捕獲能力在XID小鼠中得以實(shí)現(xiàn)。

有研究表明存在于分枝桿菌細(xì)胞壁上的脂甘露糖阿拉伯糖聚糖(LAM)和脂甘露聚糖(LM)對(duì)機(jī)體免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)有重要意義[14]。em bC基因則參與了前體LM合成LAM的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[15]。李婭莎等[16]根據(jù)基因敲除方法,首先以質(zhì)粒p2N IL為載體構(gòu)建了卡介苗em bC基因打靶載體,篩選鑒定后將陽(yáng)性克隆后電轉(zhuǎn)入卡介苗中,從而構(gòu)建出卡介苗em bC基因敲除株,使其細(xì)胞壁上的LMs/LAMs的比例發(fā)生改變,為卡介苗免疫活性的研究奠定了可靠基礎(chǔ)。

三、基因敲除在結(jié)核分枝桿菌毒力基因研究中的應(yīng)用

毒力基因的研究對(duì)于闡明結(jié)核的發(fā)病機(jī)理,開(kāi)發(fā)抗結(jié)核新藥及結(jié)核疫苗有非常重要的意義。SecA1和SecA2是目前研究較多的毒力基因,在結(jié)核分枝桿菌中,SecA1是最基本的總務(wù)蛋白,而SecA2則是輔助分泌因子。Miriam等[17]通過(guò)基因敲除技術(shù)構(gòu)建了結(jié)核分枝桿菌SecA2缺失突變株,該突變株在大鼠體內(nèi)的毒力有明顯減弱。通過(guò)比較野生型結(jié)核分枝桿菌和SecA2缺失突變株,發(fā)現(xiàn)超氧化物歧化酶A(SodA)是依賴SecA2分泌的蛋白,而SodA缺乏經(jīng)典的蛋白排出信號(hào)序列,提示SodA排出方式是一種新的分泌旁路,Miriam等[17]的研究表明這種分泌旁路是結(jié)核分枝桿菌逃避巨噬細(xì)胞殺傷的毒力機(jī)制之一。

已有研究表明,RD1是卡介苗和毒力菌株之間惟一有差別的區(qū)域,卡介苗不含RD1,而RD1存在于所有結(jié)核分枝桿菌有毒菌株中。Lewis等[18]敲除了H37Rv強(qiáng)毒株中的RD1基因,并研究其感染人單核細(xì)胞(T HP-1)、由人外周血單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞及C57BL/6小鼠后的毒力變化,發(fā)現(xiàn)在以上3種系統(tǒng)中,H37Rv RD1基因缺失突變株的毒力比結(jié)核分枝桿菌的毒力有顯著下降,并與卡介苗類似。因此,研究RD1基因?qū)τ诹私饨Y(jié)核分枝桿菌的毒力及卡介苗的減毒作用都具有非常重要的意義。

結(jié) 語(yǔ)

基因敲除技術(shù)在結(jié)核分枝桿菌對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡作用及結(jié)核疫苗的研究等方面應(yīng)用較為廣泛,但在毒力基因、耐藥性及臨床診斷方面的應(yīng)用較少。研究結(jié)核分枝桿菌毒力基因?qū)τ趶氐琢私夂涂刂平Y(jié)核分枝桿菌具有非常重要的意義。目前,雖然成功證實(shí)了一些結(jié)核分枝桿菌的毒力基因,但對(duì)毒力基因的調(diào)控機(jī)制及其功能卻知之甚少,而基因敲除技術(shù)在基因功能的研究方面有其獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值。由于基因敲除可以實(shí)現(xiàn)靶基因功能的完全喪失,而基因沉默是使基因不表達(dá)或低表達(dá),因此其對(duì)毒力基因及耐藥基因功能的研究具有RNAi等基因沉默技術(shù)無(wú)法替代的作用。相信隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展,基因敲除技術(shù)在結(jié)核病各方面的研究中將會(huì)迎來(lái)更美好的應(yīng)用前景。

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