黃先琪 杜芳玲 魏丹丹 張偉 劉洋,* 萬臘根

(1 南昌大學公共衛(wèi)生學院，南昌 330006；2 南昌大學第一附屬醫(yī)院，南昌 330006)

肺炎克雷伯菌是在醫(yī)院感染和社區(qū)環(huán)獲得性感染中的一種重要的人類病原體，可引起肝膿腫、血流感染、尿路感染等多種感染[1-2]，尤其是危重癥患者[3]。近年來，隨著抗生素的廣泛應用及侵入性診療技術(shù)的廣泛開展，肺炎克雷伯菌引起的血流感染呈現(xiàn)出增長的趨勢，嚴重威脅患者的生命[4]。有研究表明[5]， 肺炎克雷伯菌引起血流感染尤其是高毒力肺炎克雷伯菌血流感染患者死亡率高，且醫(yī)療費用昂貴。毒力質(zhì)粒pLVPK是高毒力肺炎克雷伯菌發(fā)揮毒力作用的重要因素，而毒力質(zhì)粒pLVPK相關(guān)基因(terW+-iutA+-rmpA+silS+)是膿腫形成的獨立危險因素[6]。本研究主要對血流感染肺炎克雷伯菌的毒力質(zhì)粒pLVPK的分布情況及毒力基因攜帶進行研究，并探討其與耐藥及耐藥基因攜帶的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 菌株來源及鑒定

收集2016年1月—2017年6月南昌大學第一附屬醫(yī)院分離96株血流感染的肺炎克雷伯菌作為實驗菌株，并剔除了同一個患者相同部位的重復菌株。采用Vitek-Compact全自動細菌鑒定儀進行生化鑒定及藥敏試驗檢測。

1.2 檢測方法

1.2.1 莢膜血清分型及毒力基因檢測

熱裂解法提取菌株DNA。采用PCR方法篩選所有肺炎克雷伯菌的高毒力莢膜血清型基因(K1、K2、K5、K20、K54和K57)，并對其進行PCR擴增8種常見毒力基因(rmpA、rmpA2、aerobactin、iutA、mrkD、iroN、magA和wcaG)，PCR的擴增引物、體系和擴增條件參照相關(guān)文獻進行[7-8]。

1.2.2 藥敏試驗和耐藥基因檢測

采用Vitek-Compact全自動微生物分析儀開展體外藥物敏感性試驗，對敏感、中介、耐藥的解釋標準參照美國臨床實驗室標準化研究所(2017年)規(guī)定的標準。PCR擴增檢測13種耐藥基因，其中4種碳青霉烯酶基因(blaVIM、blaNDM、blaKPC和blaOXA-48)、3種β-內(nèi)酰胺酶基因(blaSHV、blaTEM和blaCTX-M)、2種16rRNA甲基化酶基因(rmtB、armA)和4種PMQR基因(qnrA、qnrB、qnrS、acc(6')-Ib-cr)，PCR的擴增引物、體系和擴增條件參照相關(guān)文獻進行[9-10]。

1.2.3 pLVPK相關(guān)基因檢測

PCR擴增檢測terW、iutA、rmpA和silS 4個基因，PCR的擴增引物、體系和擴增條件參照相關(guān)文獻進行。根據(jù)參考文獻[11]，將terW+-iutA+-rmpA+silS+定義為毒力質(zhì)粒pLVPK陽性菌株，其余為毒力質(zhì)粒pLVPK陰性菌株。

1.2.4 pLVPK質(zhì)粒的S1-PFGE及Southern blot

以rmpA2基因設計探針，參照參考文獻先對攜帶pLVPK質(zhì)粒的菌株進行S1-PFGE及Southern Blot檢測[6]。

1.2.5 統(tǒng)計分析

使用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，根據(jù)是否攜帶pLVPK分組，對其莢膜血清分型、毒力基因、抗菌藥物的耐藥性及耐藥基因進行比較。使用χ2檢驗進行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 血流感染肺炎克雷伯菌毒力質(zhì)粒pLVPK的分布及其與莢膜血清分型的關(guān)系(表1)

血流感染肺炎克雷伯菌中毒力質(zhì)粒pLVPK攜帶率39.6%。毒力質(zhì)粒pLVPK陽性菌株K1莢膜血清分型率顯著高毒力質(zhì)粒pLVPK陰性菌株，而在其他非高毒力莢膜血清分型上，毒力質(zhì)粒pLVPK陽性菌株顯著低于毒力質(zhì)粒pLVPK陰性菌株。同時我們采用S1-PFGE及Southern Blot驗證了毒力質(zhì)粒pLVPK的存在，如圖1所示。

2.2 血流感染肺炎克雷伯菌的毒力基因分布

除allS基因全陰外，毒力質(zhì)粒pLVPK陽性菌株毒力基因的攜帶率均顯著高于毒力質(zhì)粒pLVPK陰性菌株。毒力基因分布見表2。

2.3 血流感染肺炎克雷伯的藥敏結(jié)果與毒力質(zhì)粒的關(guān)系

除酶復合制劑哌拉西林/三唑巴坦外，其余抗菌藥物中毒力質(zhì)粒pLVPK陽性菌株耐藥率均顯著低于毒力質(zhì)粒pLVPK陰性菌株(P＜0.05)。此外，我們還在毒力質(zhì)粒pLVPK陽性菌株中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)ESBL率高達42.11%，對碳青霉烯類抗生素耐藥率也高達15.79%，詳見表3。

表1 血流感染肺炎克雷伯菌毒力質(zhì)粒分布與莢膜血清型的關(guān)系Tab.1 Relationship between the distribution of virulence plasmid and capsule serotype of Klebsiella pneumoniae causing bloodstream infection

圖1 以毒力質(zhì)粒rmpA2為靶標基因?qū)Χ玖|(zhì)粒pLVPK的S1-PFGE及Southern bolt圖Fig.1 S1-PFGE and Southern hybridisation of the marker gene of the virulence plasmid rmpA2

表2 血流感染肺炎克雷伯菌的毒力基因分布與毒力質(zhì)粒攜帶的關(guān)系Tab.2 Relationship between virulence gene distribution and virulence plasmid in Klebsiella pneumoniae causing bloodstream infection

2.4 血流感染肺炎克雷伯菌耐藥基因及其與毒力質(zhì)粒攜帶的關(guān)系

毒力質(zhì)粒pLVPK陽性菌株blaKPC、blaTEM、rmtB、qnrB及acc(6')-Ib-cr基因的攜帶率顯著低于毒力質(zhì)粒pLVPK陰性菌株，如表4所示。

表3 血流感染肺炎克雷伯菌的藥敏結(jié)果及與毒力質(zhì)粒關(guān)系Tab.3 The relationship between the drug sensitivity and the virulence plasmid of Klebsiella pneumoniae causing bloodstream infection

表4 血流感染肺炎克雷伯菌耐藥基因攜帶與毒力質(zhì)粒的關(guān)系Tab.4 Relationship between drug resistance genes and virulence plasmid of Klebsiella pneumoniae causing bloodstream infection

3 討論

肺炎克雷伯菌是造成些年來醫(yī)院感染和社區(qū)獲得性感染最常見的病原體之一，其造成的血流感染直接危及患者的生命[12]。近年來，高毒力肺炎克雷伯菌不斷報道，已經(jīng)逐漸成為全球性感染病原體[13]。隨著抗菌藥物的廣泛應用，耐藥已經(jīng)成為了高毒力肺炎克雷伯菌治療的一大難題，也直接影響了患者的治療費用和預后。

毒力質(zhì)粒pLVKP是首次從高毒力肺炎克雷伯菌CG43上分離得到的213kb的質(zhì)粒[14]，包括CPS合成調(diào)節(jié)基因rmpA2和rmpA，鐵攝入系統(tǒng)基因iucABCD、iutA、iroBCDN、fepBC和fecIRA，金屬抗性基因(如銀抗性基因silS、亞碲酸鹽抗性基因terW等)?，F(xiàn)有報道發(fā)現(xiàn)terW+-iutA+-rmpA+silS+作為pLVPK質(zhì)粒的代表性基因及衍生物，可有效的指示高毒力質(zhì)粒pLVPK的存在[6]。毒力質(zhì)粒pLVPK直接影響高毒力肺炎克雷伯菌的毒力，在高毒力肺炎克雷伯菌的致病中發(fā)揮重要作用，然而其在血流感染肺炎克雷伯菌中的分布及其與耐藥性的關(guān)系尚未見報道。本研究我們從臨床分離96株血流感染的肺炎克雷伯菌中篩選高毒力質(zhì)粒pLVPK的存在情況，并結(jié)合其耐藥性與毒力基因攜帶，探究毒力質(zhì)粒pLVPK在高毒力肺炎克雷伯菌致病及耐藥中的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)除了allS和mrkD外，毒力質(zhì)粒pLVPK陽性肺炎克雷伯菌對其他毒力基因(rmpA、rmpA2、magA和iutA等)的攜帶率均顯著高于pLVPK質(zhì)粒陰性菌株。這表明毒力質(zhì)粒pLVPK的存在有助于血流感染肺炎克雷伯菌毒力基因的攜帶，抑或毒力質(zhì)粒pLVPK易存在于攜帶多種毒力基因的血流感染肺炎克雷伯菌中。在這些差異的毒力基因中，我們發(fā)現(xiàn)部分毒力基因如rmpA2、iroN及iutA等存在于毒力質(zhì)粒pLVPL上，但也有部分毒力基因如rmpA、magA、wcaG等則存在于染色體上，這也表明毒力質(zhì)粒pLVPK還可影響毒力基因的攜帶。在耐藥上，除酶復合制劑外，毒力質(zhì)粒pLVPK陽性菌株的耐藥均顯著低于毒力質(zhì)粒pLVPK陰性菌株。這與以往的報道相似[15]，表明毒力質(zhì)粒pLVPK的攜帶會干擾耐藥性的形成，但本研究在毒力質(zhì)粒陽性菌株中我們?nèi)园l(fā)現(xiàn)部分耐藥菌株的存在，甚至有部分菌株為碳青霉烯類耐藥菌株的存在，需要引起臨床的重視[16]。針對其耐藥基因檢測研究也發(fā)現(xiàn)，在blaKPC、blaTEM、rmtB、qnrB及acc(6')-Ib-cr基因的攜帶上，毒力質(zhì)粒pLVPK陽性菌株均顯著低于毒力質(zhì)粒pLVPK陰性菌株。但在毒力質(zhì)粒pLVPK陽性的菌株中我們也發(fā)現(xiàn)了如KPC基因等耐藥基因的存在，表明相關(guān)質(zhì)粒介導的耐藥基因也已播散至高毒力肺炎克雷伯菌株中，應引起臨床及院感的高度重視[17-18]。

綜上所述，毒力質(zhì)粒pLVPK的攜帶直接影響高毒力肺炎克雷伯菌的毒力基因攜帶及耐藥特征，毒力質(zhì)粒pLVPK常存在于K1莢膜血清分型菌株，其耐藥基因的攜帶雖然較毒力質(zhì)粒陰性菌株低，但也出現(xiàn)了blaKPC等多種耐藥基因攜帶的毒力質(zhì)粒陽性菌株，需引起臨床的重視，防止高毒力高耐藥肺炎克雷伯菌的暴發(fā)流行。