韓江雪 劉憶霜 肖春玲

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，北京 100050)

細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生與傳播，使細(xì)菌感染性疾病的臨床治療面臨巨大的挑戰(zhàn)。目前臨床上廣泛使用的抗細(xì)菌藥物大多數(shù)還是20世紀(jì)發(fā)現(xiàn)的抗生素或其衍生物，在長(zhǎng)期的選擇壓力下，細(xì)菌對(duì)已有抗菌藥物產(chǎn)生了多種耐藥機(jī)制，即便曾經(jīng)被稱(chēng)為“最后一道防線(xiàn)”的碳青霉烯類(lèi)藥物也未能幸免[1]。2016年，我國(guó)臨床分離的肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)的耐藥率大于15%，而銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)的耐藥率分別接近30%和70%，均高于2015年的耐藥率[2]。

與細(xì)菌耐藥問(wèn)題相對(duì)應(yīng)的是新型抗菌藥物的匱乏。半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，僅有利奈唑胺、達(dá)托霉素、貝達(dá)喹啉、德拉馬尼以及限于局部用藥的瑞他帕林5種新型抗菌藥物上市[3-5]，而這些藥物僅對(duì)革蘭陽(yáng)性菌和結(jié)核分枝桿菌有效，使得革蘭陰性菌特別是耐藥陰性菌引起的感染成為感染性疾病臨床治療中最大的難題，尋找抗耐藥陰性菌的藥物迫在眉睫。

針對(duì)病原微生物生理代謝篩選和研制藥物的進(jìn)展緩慢。正因?yàn)槿绱耍硪环N抗耐藥細(xì)菌藥物的研發(fā)策略逐漸被重視，即針對(duì)耐藥機(jī)制，篩選和發(fā)現(xiàn)抗菌藥物的增效劑，瓦解細(xì)菌的耐藥防線(xiàn)，恢復(fù)細(xì)菌對(duì)臨床現(xiàn)有抗菌藥物的敏感性。截至目前抗菌藥物增效劑中最為成功的就是β-內(nèi)酰胺酶抑制劑。β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物具有高效低毒的良好特性，是全球使用最為廣泛的一類(lèi)抗菌藥物[6]，在我國(guó)臨床使用率為62.1%。但伴隨著β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物的廣泛使用，細(xì)菌通過(guò)產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶、改變細(xì)胞壁或外膜的通透性、靶標(biāo)蛋白突變、以及表達(dá)外排泵等機(jī)制等對(duì)此類(lèi)藥物耐受，而其中最主要的機(jī)制是通過(guò)產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶導(dǎo)致藥物水解失活[7]，因此篩選新的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，有可能獲得各種新的抗菌藥物增效劑，恢復(fù)耐藥菌對(duì)這一大類(lèi)抗菌藥物的敏感性。

1 β-內(nèi)酰胺酶與細(xì)菌耐藥性

β-內(nèi)酰胺酶的作用是對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物進(jìn)行水解使之失活。從化學(xué)機(jī)制上可以將β-內(nèi)酰胺酶分為兩大類(lèi)，一類(lèi)是活性位點(diǎn)為絲氨酸殘基的絲氨酸β-內(nèi)酰胺酶(serine-β-lactamases, SBLs)，在Ambler分類(lèi)上包括A、C、D類(lèi)β-內(nèi)酰胺酶，另一類(lèi)則是活性中心依賴(lài)鋅離子的金屬β-內(nèi)酰胺酶(metallo-β-lactamases, MBLs)，包括B類(lèi)β-內(nèi)酰胺酶[8]。在過(guò)去的70年間，SBLs，如TEM酶、SHV酶、CTX-M酶、AmpC酶等一直在β-內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥機(jī)制中占據(jù)主導(dǎo)地位，克拉維酸等SBLs抑制劑在臨床上的成功應(yīng)用也切實(shí)改善了β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物的耐藥問(wèn)題[9]。然而，隨著B(niǎo)cII酶、BlaB酶、CcrA酶、IMP-1酶、VIM-2酶、VIM-4酶、VIM-7酶、SPM-1酶和GIM-1酶等MBLs的廣泛傳播，特別是可水解除氨曲南外幾乎所有的β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的NDM-1的檢出，使得β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物耐藥形勢(shì)更為嚴(yán)峻。近年來(lái)，在世界范圍內(nèi)又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了多種NDM型的β-內(nèi)酰胺酶(依次命名為NDM-1～NDM-17)，這些酶與NDM-1相比有一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的氨基酸替換，對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的水解活性也有一定的差異[10-11]。

廣泛傳播的MBLs導(dǎo)致了更為嚴(yán)重的耐藥問(wèn)題：其一，MBLs通常能水解包括碳青霉烯類(lèi)在內(nèi)的大多數(shù)β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物，而由于SBLs和MBLs的結(jié)構(gòu)差異，使得現(xiàn)有的SBLs抑制劑(如克拉維酸、舒巴坦等)對(duì)MBLs無(wú)抑制活性，而且目前臨床上尚無(wú)可用的MBLs抑制劑；其二，隨著SBLs和MBLs共存耐藥菌株的增多，即便獲得了可用于臨床的MBLs抑制劑，也難以單獨(dú)對(duì)抗SBLs和MBLs共存的耐藥菌，勢(shì)必需要更加復(fù)雜的聯(lián)合給藥方案[12]。因此，篩選能同時(shí)對(duì)SBLs和MBLs具有抑制作用的β-內(nèi)酰胺酶抑制將能更有效地維持臨床上最為廣泛使用的β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物的活性。

2 SBLs抑制劑(圖1)

至今已有克拉維酸、舒巴坦、三唑巴坦、阿維巴坦和vaborbactam 5種SBLs抑制劑上市，并在臨床治療中應(yīng)用廣泛。SBLs抑制劑與β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物的聯(lián)用有效逆轉(zhuǎn)了由于SBLs引起的β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物耐藥問(wèn)題，此外還有數(shù)種不同結(jié)構(gòu)類(lèi)型的新型SBLs抑制劑已經(jīng)進(jìn)入到臨床研究階段[13]，期待不遠(yuǎn)的將來(lái)會(huì)有多種新結(jié)構(gòu)類(lèi)型的β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物增敏劑應(yīng)用于臨床。

圖1 SBLs抑制劑Fig.1 Serine-β-lactamases inhibitors

2.1 具有β-內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)的SBLs抑制劑

克拉維酸、舒巴坦和三唑巴坦是20世紀(jì)70～80年代研制成功的并已廣泛應(yīng)用的SBLs抑制劑，它們均具有β-內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)，通過(guò)與β-內(nèi)酰胺酶形成穩(wěn)定而且不可逆的結(jié)合，抑制其發(fā)揮對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的水解作用，從而提高了青霉素類(lèi)和頭孢菌素類(lèi)抗生素對(duì)產(chǎn)SBLs菌株的敏感性[13]?？死S酸是于1976年從棒狀鏈霉菌的發(fā)酵液中分離得到的天然來(lái)源的SBLs抑制劑[14]，也是第一個(gè)用于臨床的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，其結(jié)構(gòu)如圖1a。在臨床上，常用其合劑克拉維酸/阿莫西林(口服劑)或克拉維酸/替卡西林(注射劑)來(lái)治療由耐藥菌導(dǎo)致的院內(nèi)重度感染?？死S酸對(duì)Richmond type Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ類(lèi)的β-內(nèi)酰胺酶有抑制作用[15]，對(duì)產(chǎn)SBLs的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、克雷伯菌、變形菌、志賀菌、假單胞菌和流感嗜血菌等都有抑制活性。在低濃度克拉維酸的作用下(＜10μg/mL)，多種產(chǎn)SBLs的耐藥菌對(duì)青霉素類(lèi)和頭孢菌素類(lèi)藥物的敏感性都可以恢復(fù)到與不產(chǎn)SBLs的細(xì)菌相同的水平[14]。

舒巴坦和三唑巴坦[15]是分別于1978年和1984年發(fā)現(xiàn)的青霉烷砜類(lèi)半合成β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，其結(jié)構(gòu)如圖1b～c。三唑巴坦與克拉維酸對(duì)SBLs的抑制作用很接近，對(duì)TEM-1的IC50分別為0.032和0.058μmo/L，對(duì)SHV-4的IC50分別為0.055和0.004μmo/L；而舒巴坦的抑制作用比較弱，其對(duì)TEM-1和SHV-4的IC50分別為1.56和0.26μmo/L[16]。當(dāng)32μg/mL舒巴坦與氨芐西林聯(lián)用時(shí)，可將氨芐西林對(duì)TEM-31耐藥菌的MIC降低16倍；而16μg/mL克拉維酸與氨芐西林聯(lián)用時(shí)，可將氨芐西林對(duì)TEM-31耐藥菌的MIC降低32倍。這3種抑制劑的抑酶譜及作用機(jī)制比較相似，對(duì)當(dāng)時(shí)最為常見(jiàn)的SBLs中的A類(lèi)β-內(nèi)酰胺酶TEM、SHV具有較強(qiáng)的抑制活性，但對(duì)同屬SBLs的C類(lèi)AmpC、D類(lèi)β-內(nèi)酰胺酶OXA活性較弱。舒巴坦/氨芐西林合劑、三唑巴坦/哌拉西林合劑均已在美國(guó)和歐洲批準(zhǔn)上市，三唑巴坦/頭孢吡肟合劑在亞洲廣泛使用，三唑巴坦/頭孢洛扎合劑也分別于2014年和2015年在美國(guó)和歐洲批準(zhǔn)上市。但是近年來(lái)β-內(nèi)酰胺酶種類(lèi)逐漸增多，很多的A類(lèi)β-內(nèi)酰胺酶對(duì)這3種抑制劑敏感性降低，研制新型β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的克服β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物耐藥菌引發(fā)的感染任重而道遠(yuǎn)。

2.2 具有二氮雜環(huán)辛烷類(lèi)化合物(DBO)結(jié)構(gòu)的SBLs抑制劑

新型SBLs抑制劑阿維巴坦于2015年上市，不同于具有β-內(nèi)酰胺類(lèi)結(jié)構(gòu)的SBLs抑制劑，是第一個(gè)用于臨床的二氮雜雙環(huán)辛烷類(lèi)化合物(DBO)，其結(jié)構(gòu)如圖1d。阿維巴坦可以與大多數(shù)A類(lèi)和C類(lèi)β-內(nèi)酰胺酶形成可逆的共價(jià)鍵，而其自身結(jié)構(gòu)又可經(jīng)逆反應(yīng)得以恢復(fù)，因此具有長(zhǎng)效抑酶作用[17]。阿維巴坦對(duì)TEM-1酶和SHV-4酶的抑制效果強(qiáng)于克拉維酸，其IC50分別為0.008和0.003μmo/L，推測(cè)其強(qiáng)活性與其長(zhǎng)效抑酶作用有關(guān)[16]。Premavathy等[18]利用臨床分離的126株銅綠假單胞菌進(jìn)行阿維巴坦與頭孢他啶聯(lián)用的體外抗菌實(shí)驗(yàn)，當(dāng)4μg/mL阿維巴坦分別與頭孢他啶、氨曲南、亞胺培南、哌拉西林聯(lián)用時(shí)，均可在不同程度上防止β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物被水解。其中，單獨(dú)使用頭孢他啶時(shí)，有65%的分離株對(duì)其敏感，而4μg/mL阿維巴坦與頭孢他啶聯(lián)用時(shí)，有94%的分離株對(duì)其敏感。在當(dāng)前的臨床治療中，阿維巴坦常與頭孢他啶聯(lián)用，阿維巴坦/頭孢他啶合劑分別于2015年和2016年在美國(guó)和歐洲批準(zhǔn)上市，而阿維巴坦/氨曲南合劑、阿維巴坦/頭孢洛林合劑仍在進(jìn)行臨床二期試驗(yàn)。

與阿維巴坦結(jié)構(gòu)相似的relebactam是針對(duì)A類(lèi)和C類(lèi)β-內(nèi)酰胺酶設(shè)計(jì)的含有哌啶基的二氮雜雙環(huán)辛烷(DBO)類(lèi)抑制劑，其結(jié)構(gòu)如圖1e。其作用機(jī)制與阿維巴坦相似。有研究結(jié)果表明其對(duì)銅綠假單胞菌中的AmpC酶、KPC-2酶以及鮑曼不動(dòng)桿菌中的AmpC酶的IC50分別為410、210和4100nmol/L，從酶抑制活性上看弱于阿維巴坦。當(dāng)亞胺培南與4μg/mL relebactam聯(lián)用時(shí)，可將亞胺培南對(duì)AmpC耐藥菌的MIC降低4倍，將亞胺培南對(duì)含KPC的肺炎克雷伯菌和腸桿菌科細(xì)菌的MIC從16～64μg/mL降至0.12～1μg/mL[19]。但是relebactam對(duì)D類(lèi)碳青霉烯酶OXA-40(OXA-24)酶沒(méi)有抑制作用，它只能逆轉(zhuǎn)產(chǎn)A類(lèi)和C類(lèi)SBLs的耐藥菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物耐藥性，對(duì)產(chǎn)D類(lèi)碳青霉烯酶的耐藥菌無(wú)能為力。目前，relebactam/亞胺培南/西司他丁已完成復(fù)雜腹腔內(nèi)感染的臨床二期試驗(yàn)，復(fù)雜尿路感染臨床三期試驗(yàn)仍在進(jìn)行中。

另外一個(gè)與阿維巴坦結(jié)構(gòu)相似的二氮雜環(huán)辛烷類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)的ETX2514是由阿斯利康合成的SBLs抑制劑，目前舒巴坦- ETX2514合劑已進(jìn)入二期臨床研究，其結(jié)構(gòu)如圖1f。ETX2514對(duì)A、C、D類(lèi)SBLs均有很好的抑制活性，對(duì)KPC-2、AmpC及OXA-24的IC50值分別為0.004、0.014和0.19μmol/L[20]。在體外抗菌實(shí)驗(yàn)中，4μg/mL ETX2514與哌拉西林聯(lián)用時(shí)，可將哌拉西林對(duì)KPC-2耐藥菌、AmpC耐藥菌及OXA-24耐藥菌的MIC分別降低16、32和8倍以上[21]。此外ETX2514在分別與哌拉西林、美羅培南、舒巴坦聯(lián)用時(shí)，提高對(duì)含A、C、D類(lèi)SBLs鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物敏感性的能力均強(qiáng)于阿維巴坦，表現(xiàn)出更好的抑制活性[20]。

2.3 非β-內(nèi)酰胺類(lèi)結(jié)構(gòu)的有機(jī)硼酸類(lèi)SBLs抑制劑

Vaborbactam(RPX7009)是于2017年上市的有機(jī)硼酸類(lèi)SBLs抑制劑，其結(jié)構(gòu)如圖1g。Vaborbactam通過(guò)與絲氨酸蛋白酶之間發(fā)生相互作用而發(fā)揮抑酶作用，vaborbactam對(duì)多種A類(lèi)(KPC-2、CTX-M-15、 SHV-12、TEM-10)和C類(lèi)(P99)的β-內(nèi)酰胺酶具有抑制作用，其Ki值分別為0.069、0.044、0.029、0.110、0.053和0.099μmol/L。除此之外，對(duì)部分D類(lèi)β-內(nèi)酰胺酶也有顯著的抑制活性[22]。Vaborbactam(RPX7009) 是一種在體內(nèi)外均具有廣譜抑制活性的SBLs抑制劑，4μg/mL的vaborbactam與美羅培南聯(lián)用，可以將美羅培南對(duì)多種含A類(lèi)β-內(nèi)酰胺酶(KPC-2/KPC-3、SME和NMC-A)的耐藥菌的MIC降低至空載體對(duì)照菌的水平；聯(lián)用其他的β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，也可有效治療多重耐藥革蘭陰性菌引發(fā)的感染[23]。其作用機(jī)制的研究表明，vaborbactam通過(guò)與絲氨酸蛋白酶之間發(fā)生相互作用而發(fā)揮了抑酶作用，但是vaborbactam對(duì)11種不同的哺乳動(dòng)物絲氨酸蛋白酶的IC50值均大于1000μmol/L，表明其對(duì)SBLs的抑制作用具有特異性。目前，vaborbactam/美羅培南合劑已于2017年在美國(guó)批準(zhǔn)上市。

3 MBLs抑制劑

雖然已經(jīng)上市的以及處于研究階段的SBLs抑制劑均對(duì)SBLs表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性，但是對(duì)MBLs卻沒(méi)有抑制作用，不能有效解決因產(chǎn)生MBLs而導(dǎo)致的β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥問(wèn)題，MBLs抑制劑的研發(fā)迫在眉睫。

目前文獻(xiàn)報(bào)道的MBLs抑制劑的抑制機(jī)制主要分為兩類(lèi)，第一類(lèi)是作用于MBLs活性中心的鋅離子：其中一種為金屬離子螯合劑，通過(guò)螯合MBLs活性中心的鋅離子，從而抑制MBLs的水解活性，如來(lái)源于真菌代謝產(chǎn)物的aspergillomarasmine A(AMA)、金屬離子螯合劑1,4,7-三氮雜環(huán)壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)和1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)；另一種為帶有二羧基的酸，如馬來(lái)酸、琥珀酸、鄰苯二甲酸等，通過(guò)與MBLs活性中心的鋅離子結(jié)合，從而抑制MBLs的水解活性；第二類(lèi)抑制劑如ebselen、magnolol等，則是作用于MBLs的氨基酸殘基。

3.1 Aspergillomarasmine A(AMA)

Aspergillomarasmine A(AMA)是一種來(lái)源于真菌發(fā)酵液的天然產(chǎn)物，它是由King等于2014年已經(jīng)通過(guò)細(xì)胞水平的篩選得到的MBLs抑制劑，是作用于活性中心鋅離子的MBLs抑制劑，AMA結(jié)構(gòu)如圖2a。AMA結(jié)構(gòu)上與乙二胺四乙酸相似的鋅離子螯合劑，但與乙二胺四乙酸相比，AMA的毒性更低且耐受性更好，說(shuō)明AMA可能具有較好的研發(fā)前景。AMA對(duì)MBLs的抑制作用具有選擇性，它能夠快速有效的抑制NDM-1酶和VIM-2酶，對(duì)NDM-1酶和VIM-2酶的IC50值分別為(4.0±1.0)和(9.6±2.4)μmol/L，Ki分別為11和7nmol/L，但是對(duì)IMP-7的抑制作用很弱；對(duì)TEM-1和CTX-M-15兩種SBLs沒(méi)有表現(xiàn)出抑制活性。體外的藥效學(xué)研究表明：美羅培南與2μg/mL濃度的AMA聯(lián)合使用，可有效殺滅含有VIM或NDM型等位基因的腸桿菌科細(xì)菌、不動(dòng)桿菌和假單胞菌等對(duì)美羅培南耐藥的菌株，幾乎完全恢復(fù)了這些耐藥微生物對(duì)美羅培南的敏感性；體內(nèi)的藥效學(xué)研究結(jié)果顯示：在感染了表達(dá)NDM-1的肺炎克雷伯菌的小鼠中，10mg/kg美羅培南與30mg/kg AMA單劑量聯(lián)用可以使感染小鼠的存活率大于95%，有效地恢復(fù)了美羅培南的活性，表明AMA和碳青霉烯類(lèi)抗生素的組合具有治療產(chǎn)MBLs碳青霉烯耐藥病原體的潛力[24-25]。

3.2 NOTA和DOTA

圖2 MBLs抑制劑Fig.2 Metallo-β-lactamases inhibitors

1,4,7-三氮雜環(huán)壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)和1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)是Somboro于2015年發(fā)現(xiàn)的金屬離子螯合劑類(lèi)型的MBLs抑制劑，其結(jié)構(gòu)如圖2b～c。NOTA和DOTA可有效地抑制NDM-1、NDM-4、VIM-1、IMP-1、IMP-8的活性，二者對(duì)MBLs的抑制作用強(qiáng)于AMA，在低至0.06mg/L濃度下，NOTA與DOTA仍可恢復(fù)碳青霉烯類(lèi)抗生素對(duì)MBLs產(chǎn)生菌的抑制活性；但在與美羅培南聯(lián)用時(shí)二者對(duì)耐藥菌抑制活性顯示出差異：美羅培南/NOTA組合的抗耐藥菌活性比美羅培南/DOTA組合的抗耐藥菌活性高32倍。這類(lèi)金屬螯合劑聯(lián)合使用亞胺培南時(shí)也可有效地恢復(fù)亞胺培南對(duì)產(chǎn)MBLs耐藥菌株的活性，表明這類(lèi)抑制劑恢復(fù)碳青霉烯類(lèi)類(lèi)藥物對(duì)耐藥菌活性的作用具有普遍性。對(duì)NOTA和DOTA的細(xì)胞毒性研究發(fā)現(xiàn)，這些化合物在應(yīng)用濃度下沒(méi)有出現(xiàn)溶血反應(yīng)，這一結(jié)果表明其他的鋅離子螯合劑也有可能作為MBLs抑制劑應(yīng)用于臨床的抗耐藥菌治療[26]，但金屬離子螯合劑對(duì)哺乳動(dòng)物體內(nèi)含鋅酶(如血管緊張素轉(zhuǎn)化酶、乙醇脫氫酶及哺乳動(dòng)物羧肽酶等)可能存在的抑制活性，是上述MBLs抑制劑在進(jìn)行藥物研發(fā)時(shí)必須面對(duì)的風(fēng)險(xiǎn)。

3.3 ME1071

ME1071是由Meiji Seika Kaisha Ltd公司開(kāi)發(fā)的一種馬來(lái)酸衍生物，其結(jié)構(gòu)如圖2d。ME1071對(duì)IMP-1及VIM-2具有明確的抑制活性，Ki值分別為0.41和120μmol/L[27]。當(dāng)ME1071為32μg/mL時(shí)，可顯著提高產(chǎn)NDM-1、IMP-1及VIM-2的耐藥菌對(duì)美羅培南、亞胺培南、比阿培南、多利培南這4種碳青霉烯類(lèi)抗生素的敏感性，其中ME1071對(duì)NDM-1耐藥菌耐藥性的逆轉(zhuǎn)效果弱于產(chǎn)IMP-1及VIM-2的耐藥菌，推測(cè)這與ME1071對(duì)NDM-1的親和力弱于IMP-1及VIM-2有關(guān)[28]。對(duì)ME1071作用機(jī)制研究結(jié)果表明，該化合物是通過(guò)與MBLs活性中心的鋅離子結(jié)合，從而抑制了MBLs對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物的水解活性。目前對(duì)ME1071的研究已經(jīng)完成了Ⅰ期臨床實(shí)驗(yàn)，期待其后續(xù)的研究進(jìn)展。

3.4 Ebselen

Ebselen是Chiou等[29]在2015年通過(guò)以含有pET28b-blaNDM-1質(zhì)粒的E.coli BL21為模式生物的全細(xì)胞模型篩選得到的非鋅離子依賴(lài)的MBLs抑制劑，其結(jié)構(gòu)如圖2e。Ebselen對(duì)NDM-1有明確的抑制活性，Ki值為(0.38±0.03)μmol/L。體外研究發(fā)現(xiàn)：Ebselen可以逆轉(zhuǎn)產(chǎn)NDM-1的耐藥菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物的耐藥性，當(dāng)Ebselen與美羅培南和氨芐西林分別以摩爾比1.3:1和1.4:1聯(lián)用時(shí)，耐藥菌對(duì)二者的敏感性分別提高128倍和16倍。對(duì)Ebselen作用機(jī)制的研究結(jié)果顯示：該化合物與NDM-1活性位點(diǎn)的Cys221形成S-Se鍵，二者之間具有強(qiáng)親和力，并可以從活性位點(diǎn)移除氫離子，使NDM-1處于失活狀態(tài)下，進(jìn)而無(wú)法發(fā)揮水解活性。Ebselen有可能發(fā)展成為作用于B1和B2類(lèi)MBLs的廣譜β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，然而，其抗氧化活性和毒性也限制了此類(lèi)藥物的開(kāi)發(fā)。

3.5 Magnolol

Magnolol(木蘭醇)是Liu等[30]于2018年通過(guò)NDM-1抑制劑模型從木蘭樹(shù)皮分離的天然產(chǎn)物中篩選得到的NDM-1抑制劑，其結(jié)構(gòu)如圖2f，Magnolol可有效地抑制NDM-1的活性，其IC50為6.47μg/mL。在體外抗菌實(shí)驗(yàn)中，聯(lián)用32μg/mL Magnolol可以將美羅培南對(duì)產(chǎn)NDM耐藥菌株E.coli ZC-YN3(NDM-1)、E.coli ZC-YN5(NDM-5)、E.coli ZC-YN7(NDM-9)的MIC降低4倍，且在3h內(nèi)殺死幾乎所有細(xì)菌，顯示出具有開(kāi)發(fā)成為MBLs抑制劑的潛力。其作用機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)：Magnolol可通過(guò)直接與NDM-1的110-200殘基附近的催化口袋結(jié)合，且與Ser217形成氫鍵，抑制NDM-1的活性。此外還有5個(gè)氨基酸殘基(Val73、Lys211、Leu218、Gly219、His250)與Magnolol的結(jié)合相關(guān)。

4 SBLs/MBLs雙重抑制劑

SBLs和MBLs在結(jié)構(gòu)上差異明顯，通常一種酶抑制劑都特異性地抑制一種β-內(nèi)酰胺酶，但在抑制劑篩選過(guò)程中仍發(fā)現(xiàn)了對(duì)兩類(lèi)β-內(nèi)酰胺酶均表現(xiàn)出抑制活性的化合物。

Schofield等[31]通過(guò)化學(xué)合成得到了環(huán)硼酸酯類(lèi)化合物，該類(lèi)化合物對(duì)SBLs/MBLs具有雙重的抑制活性，而環(huán)硼酸酯類(lèi)化合物2為Schofield等設(shè)計(jì)合成的5個(gè)化合物中活性最好的一個(gè)化合物，其結(jié)構(gòu)如圖3。環(huán)硼酸酯類(lèi)化合物2對(duì)SBLs和MBLs均有明顯的抑制活性，其對(duì)TEM-1和VIM-2、NDM-1的IC50分別為0.003、0.003和0.029μmol/L。在體外抗菌實(shí)驗(yàn)中，25μg/mL環(huán)硼酸酯類(lèi)化合物2與美羅培南聯(lián)用時(shí)，可將美羅培南對(duì)NDM-1耐藥菌的MIC降低32倍。對(duì)其作用機(jī)制的研究表明：該化合物通過(guò)模擬β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物被酶水解的過(guò)程中產(chǎn)生的高能四面體中間產(chǎn)物，發(fā)揮抑制SBLs和MBLs活性的作用。這類(lèi)化合物的發(fā)現(xiàn)為研發(fā)SBLs/MBLs雙重抑制劑的可行性提供了支持。有研究發(fā)現(xiàn)環(huán)狀硼酸鹽也可以通過(guò)相同的機(jī)制有效地抑制一些青霉素結(jié)合蛋白(PBP)的活性。該研究結(jié)果提示我們，通過(guò)篩選模擬常見(jiàn)的高能四面體中間化合物有可能獲得具有MBLs、SBLs或PBP抑制活性的新型β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素增效劑。

圖3 SBLs/MBLs雙重抑制劑Fig.3 Dual action inhibitors of SBLs and MBLs

單一類(lèi)別的化合物能夠同時(shí)抑制SBLs和MBLs的實(shí)驗(yàn)結(jié)果在本實(shí)驗(yàn)室的藥物篩選中也被發(fā)現(xiàn)了，通過(guò)聯(lián)合使用SBLs和MBLs抑制劑篩選模型，本研究篩選得到了化合物IMB-XW1和IMB-XH5，這兩個(gè)化合物對(duì)A類(lèi)SBLs中的BlaC和MBLs中的NDM-1都具有抑制活性，IMB-XW1對(duì)BlaC和NDM-1的IC50分別為9.75和1.49μmol/L，IMB-XH5對(duì)BlaC和NDM-1的IC50分別為2.24和0.25μmol/L。由此我們相信，聯(lián)合使用SBLs和MBLs抑制劑高通量篩選模型，從不同來(lái)源的樣品中篩選SBLs/MBLs雙重抑制劑，有可能獲得新型的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，從而獲得可有效治療具有多重耐藥機(jī)制的耐藥菌引發(fā)的感染，為耐藥陰性菌的臨床治療提供有效的藥物。

5 結(jié)語(yǔ)

隨著各種耐藥菌的不斷出現(xiàn)和廣泛傳播，細(xì)菌耐藥問(wèn)題成為世界范圍內(nèi)威脅公眾健康的重要問(wèn)題。β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素是目前應(yīng)用最為廣泛的抗生素，但陸續(xù)出現(xiàn)的多種耐藥機(jī)制，大大降低了β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的治療效果。針對(duì)其耐藥機(jī)制，研制新型的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，是逆轉(zhuǎn)此類(lèi)藥物耐藥性的重要手段，而研究人員在SBLs抑制劑、MBLs抑制劑、以及SBLs/MBLs雙重抑制劑的研究方面所取得的進(jìn)展，為獲得新型β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物的增效劑帶來(lái)了希望，雖然距離將其開(kāi)發(fā)成臨床可用的藥物還需要艱難而漫長(zhǎng)的歷程，但我們堅(jiān)信在藥學(xué)工作者的不斷努力下，新型β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物增效劑會(huì)在不久的將來(lái)應(yīng)用于耐藥菌的臨床治療。