陳永艷 呂佳 邢方瀟 張嵐,* 盧曉華 金寧

(1 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所，北京 100050；2 中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，北京 100029 )

自1940年青霉素應(yīng)用于臨床至今，抗生素已達(dá)幾千種，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、畜牧業(yè)。關(guān)于環(huán)境水體及飲用水中抗生素的來源、分布水平、檢測(cè)分析方法及水體中抗生素對(duì)健康的影響已有了較多的綜合分析，目前抗生素檢測(cè)方法多為液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[1-3]，可實(shí)現(xiàn)環(huán)境水體中抗生素殘留量測(cè)定。由于環(huán)境水體中抗生素含量較低，通常需要將水樣運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后立即或儲(chǔ)存一段時(shí)間后經(jīng)過固相萃取等前處理后再進(jìn)行檢測(cè)分析。目前實(shí)驗(yàn)室常用的儲(chǔ)存方法包括冷藏或樣品提取富集后冷藏，有關(guān)保存后水樣中抗生素的穩(wěn)定性卻鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室先期在全國(guó)范圍內(nèi)開展飲用水中抗生素等潛在污染物調(diào)查與監(jiān)測(cè)工作[4-6]，根據(jù)不同流域抗生素的污染種類和污染水平均有所不同，通過對(duì)檢出頻率、污染水平的比較，最終選取5種磺胺類、喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類抗生素進(jìn)行穩(wěn)定性研究，其中磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噁唑?yàn)榛前奉?；氟甲喹、噁喹酸為喹諾酮類；苯唑西林為β-內(nèi)酰胺類抗生素，這也與文獻(xiàn)[7-9]報(bào)道的磺胺類、喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類抗生素在環(huán)境水體中污染狀況相吻合。因此開展這些抗生素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性研究，使抗生素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值準(zhǔn)確可靠，對(duì)保證樣品測(cè)定時(shí)達(dá)到準(zhǔn)確定量具有十分重要的意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(XEVO Micro TQS)(美國(guó)Waters公司)，配有電噴霧離子源(ESI)；超聲波清洗儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；渦流振蕩器(美國(guó)Talboys公司)；感量0.0001g電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；0.22μm聚醚砜濾膜(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)。

甲醇(HPLC-MS級(jí)，美國(guó)Fisher公司)；甲酸(LCMS級(jí)，美國(guó)Fisher公司)；高純氮?dú)?、氬氣；?shí)驗(yàn)用水為超純水。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：磺胺二甲嘧啶(99.50%，美國(guó)Chemservice公司)；磺胺甲噁唑(99.50%，美國(guó)Chemservice公司)；氟甲喹(99.30%，美國(guó)Sigma公司)；噁喹酸(99.50%，美國(guó)Chemservice公司)；苯唑西林(99%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1 液相色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1mm×100mm, 1.8μm)，柱溫：40℃。進(jìn)樣體積：10μL。流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B：甲醇，流速：0.35 mL/min。洗脫程序見表1。

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧電離(ESI)，正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式分析，源溫度120℃，脫溶劑溫度350℃，脫溶劑氣流量650L/Hr，碰撞氣流量50L/Hr，毛細(xì)管電壓2.0kV。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)條件見表2。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 方案

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)先期在全國(guó)范圍內(nèi)開展的飲用水中抗生素等潛在污染物調(diào)查與監(jiān)測(cè)工作，選取生活飲用水中檢出率較高、具有代表性的5種不同類別的抗生素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，使用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)并定量。對(duì)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液分別4℃冷藏保存及20℃常溫保存，觀察其穩(wěn)定性情況，直至量值變化10%以上的時(shí)間點(diǎn)，并在該時(shí)間點(diǎn)終止實(shí)驗(yàn)；在飲用水空白水樣中添加一定濃度的抗生素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，將樣品分別4℃冷藏保存及20℃常溫保存，觀察其穩(wěn)定性情況。

要求每組涉及前、中、后最少3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)不少于2個(gè)獨(dú)立重復(fù)測(cè)試數(shù)據(jù)。

1.3.2 考察樣溶液配制

(1)分別準(zhǔn)確稱取磺胺甲噁唑、氟甲喹、噁喹酸、磺胺二甲嘧啶、苯唑西林標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)1.0mg，用甲醇將其溶解定容至100mL容量瓶中，即得濃度為10mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

(2)準(zhǔn)確移取“(1)”中混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液10～100mL容量瓶中，用甲醇定容，混勻。該標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為1000μg/L，將其分裝至兩個(gè)棕色標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)液瓶中，常溫(20℃)儲(chǔ)存、4℃儲(chǔ)存，備用。每次上機(jī)測(cè)定前，將該標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇稀釋50倍后上機(jī)測(cè)定；

表1 5種抗生素測(cè)定時(shí)的洗脫梯度Tab.1 Gradient elution program for the analysis of the 5 antibiotics

表2 5種抗生素的相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)Tab.2 MS parameters of the 5 antibiotics

(3)準(zhǔn)確移取“(1)”中混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.10～100mL容量瓶中，用甲醇定容，混勻。該標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為10μg/L，將其分裝至兩個(gè)棕色標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)液瓶中，常溫(20℃)儲(chǔ)存、4℃儲(chǔ)存，備用。每次上機(jī)直接測(cè)定。

(4)準(zhǔn)確移取“(1)”中混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.50～500mL容量瓶中，用空白自來水樣品定容，混勻。該樣品中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度為20μg/L，將其分裝至兩個(gè)棕色玻璃螺口試劑瓶中，常溫(20℃)儲(chǔ)存、4℃儲(chǔ)存，備用。樣品每次上機(jī)前經(jīng)0.22μm濾膜過濾后直接測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 方法檢出限、定量限

以目標(biāo)分析物色譜峰信噪比S/N=3和S/N=10計(jì)算對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為檢出限和定量限，詳見表3。

表3 5種抗生素的檢出限、定量限Tab.3 Limits of detection (LODs) and limits of quantitation (LOQs) of the 5 antibiotics

2.2 結(jié)果分析

本研究對(duì)飲用水檢測(cè)中抗生素的穩(wěn)定性情況進(jìn)行研究，其中包含其在飲用水樣品溶液中的穩(wěn)定性以及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在甲醇溶液中的穩(wěn)定性。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制通常使用甲醇溶液，樣品前處理中固相萃取試劑通常使用甲醇，因此選取不同溶劑對(duì)抗生素穩(wěn)定性影響時(shí)，考察水和甲醇兩種溶劑。

2.2.1 不同的溶劑對(duì)抗生素穩(wěn)定性影響不同

分別對(duì)10和1000μg/L標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)甲醇溶液，以及加標(biāo)量為20μg/L的實(shí)際樣品進(jìn)行不同保存溫度下的量值穩(wěn)定性評(píng)估。本研究涉及的5種典型抗生素，在甲醇溶液體系內(nèi)磺胺甲噁唑、氟甲喹、噁喹酸、磺胺二甲嘧啶、苯唑西林標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均在2d內(nèi)降解率達(dá)到22.1%以上，詳見表4～7。在水樣樣品基質(zhì)中，除苯唑西林外，其他幾種抗生素7d內(nèi)均未發(fā)生顯著降解，詳見表8～9。苯唑西林雖然降解顯著，但在同等儲(chǔ)存溫度條件下水溶液中抗生素降解速率低于甲醇溶液。

2.2.2 溫度變化對(duì)抗生素穩(wěn)定性的影響程度不同

本研究涉及的5種典型抗生素，部分抗生素穩(wěn)定性受儲(chǔ)存溫度影響較為明顯。苯唑西林受儲(chǔ)存溫度影響最大，如圖1所示。苯唑西林1000μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液在20℃常溫儲(chǔ)存1d后降解率高達(dá)28.5%，而其冷藏儲(chǔ)存降解率僅為2.2%，10μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液在常溫儲(chǔ)存1d后降解率高達(dá)96.2%，而其冷藏儲(chǔ)存降解率為20.2%。20μg/L樣品溶液在20℃常溫儲(chǔ)存2d后降解率高達(dá)77.92%，而其冷藏儲(chǔ)存降解率為15.42%，7d后降解率為88.85%，而其冷藏儲(chǔ)存降解率為28.46%。

表4 10μg/L抗生素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在4℃避光儲(chǔ)存穩(wěn)定性情況Tab.4 The stability of antibiotic standard substances (10μg/L, stored in dark at 4℃)

表5 10μg/L抗生素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在 20℃避光儲(chǔ)存穩(wěn)定性情況Tab.5 The stability of antibiotic standard substances (10μg/L, stored in dark at 20℃)

表6 1000μg/L抗生素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在4℃避光儲(chǔ)存穩(wěn)定性情況Tab.6 The stability of antibiotic standard substances (1000μg/L, stored in dark at 4℃)

表7 1000μg/L抗生素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在 20℃避光儲(chǔ)存穩(wěn)定性情況Tab.7 The stability of antibiotic standard substances (1000μg/L, stored in dark at 20℃)

表8 自來水樣品加標(biāo)20μg/L在4℃避光儲(chǔ)存穩(wěn)定性情況Tab.8 The stability of the tap water sample spiked with 20μg/L standard (stored in dark at 4℃)

表9 自來水樣品20μg/L 20℃避光儲(chǔ)存穩(wěn)定性情況Tab.9 The stability of the tap water sample spiked with 20μg/L standard (stored in dark at 20℃)

圖1 苯唑西林在甲醇溶液中的穩(wěn)定性Fig.1 The stability of oxacillin in methanol solution

部分抗生素穩(wěn)定性受儲(chǔ)存溫度影響不明顯，磺胺甲噁唑、氟甲喹、噁喹酸、磺胺二甲嘧啶在自來水樣品中，常溫保存或冷藏保存，均未發(fā)生顯著降解，而在甲醇溶液中，雖然在一定程度上降解，但受保存溫度影響不大，如圖2～5所示。

磺胺甲噁唑10μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液在冷藏和常溫儲(chǔ)存1d后降解率分別為16.8%和12.4%，1000μg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液在冷藏和常溫儲(chǔ)存1d后降解率均小于10%，2d后降解率分別為26.2%和27.4%。

圖2 磺胺甲噁唑在甲醇溶液中的穩(wěn)定性Fig.2 The stability of sulfamethoxazole in methanol solution

圖3 氟甲喹在甲醇溶液中的穩(wěn)定性Fig.3 The stability of flumequine in methanol solution

圖4 噁喹酸在甲醇溶液中的穩(wěn)定性Fig.4 The stability of oxolinic acid in methanol solution

圖5 磺胺二甲嘧啶在甲醇溶液中的穩(wěn)定性Fig.5 The stability of sulfamethazine in methanol solution

氟甲喹10μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液在冷藏和常溫儲(chǔ)存1d后降解率均小于0.5%，2d后降解率分別為36.3%和35.5%；1000μg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液在冷藏和常溫儲(chǔ)存1d后降解率均小于10%，2d后降解率分別為43.6%和40.7%。

噁喹酸10μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液在冷藏和常溫儲(chǔ)存1d后降解率均小于5%，2d后降解率分別為22.1%和22.7%；1000μg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液在冷藏和常溫儲(chǔ)存1d后降解率小于等于10%，2d后降解率分別為26.6%和27.2%。

磺胺二甲嘧啶10μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液在冷藏和常溫儲(chǔ)存1d后降解率分別為10.0%和11.2%，2d后降解率分別為58.1%和56.2%，1000μg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液在冷藏和常溫儲(chǔ)存1d后降解率均小于10%，2d后降解率分別為38.4%和40.1%。

3 結(jié)論

通過對(duì)飲用水檢測(cè)中5種抗生素穩(wěn)定性的研究可以發(fā)現(xiàn)，抗生素的穩(wěn)定性與其溶解的溶劑有關(guān)，在水溶液中穩(wěn)定性優(yōu)于甲醇溶液；部分抗生素穩(wěn)定性與儲(chǔ)存溫度有關(guān)，如低溫儲(chǔ)存顯著延緩苯唑西林素降解。因此，測(cè)定飲用水中抗生素時(shí)，樣品采集后盡快測(cè)定，盡量縮短樣品前處理時(shí)間，有利于檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

抗生素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液若不能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)配現(xiàn)用，也應(yīng)當(dāng)注意儲(chǔ)備液有效期。在飲用水檢測(cè)中對(duì)樣品及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)建立良好的儲(chǔ)存和使用條件, 避免和減少抗生素的降解，對(duì)加強(qiáng)抗生素檢測(cè)過程中的質(zhì)量控制、提高檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性具有重要參考價(jià)值。