肖瑤 楊梅 陳紅

(成都市食品藥品檢驗研究院，成都 610045)

滴眼劑是指由原料藥物與適宜輔料制成的供滴入眼內的無菌液體制劑[1]。國內滴眼劑常為多劑量制劑，開瓶后一般可使用4周，加入適當抑菌劑是保證安全使用的關鍵。通過分析國內滴眼劑說明書發(fā)現(xiàn)，僅部分說明書標注了所用抑菌劑種類，而標明其含量的則更少。本試驗收集樣品40批，包括抗生素滴眼液、抗病毒滴眼液、緩解視疲勞滴眼液等，主要含抑菌劑為羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、苯甲酸、山梨酸和硫柳汞。

目前，滴眼劑中抑菌劑的檢查方法常為HPLC法，待測滴眼劑種類較少，且不同滴眼劑測定方法不一致，測定的抑菌劑種類也較少[2]。為了高通量快速分析各種滴眼劑中的抑菌劑，本試驗建立了UPLC/MS/MS法定量分析滴眼劑中6種抑菌劑(羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、苯甲酸、山梨酸和硫柳汞),有助于快速篩查滴眼劑所含抑菌劑種類及定量。

1 儀器與試藥

Waters ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀(美國Waters公司)，Waters Xevo TQ MS串聯(lián)質譜儀(美國Waters公司)，Milli-Q純水器(美國Millipore公司)。

羥苯甲酯(含量99.6%，批號：100278-201103)，羥苯乙酯(含量99.9%，批號：100847-201604)，羥苯丙酯(含量99.6%，批號：100444-201102)，苯甲酸(含量100.0%，批號：100419-201302)，均來源于中國食品藥品檢定研究院；山梨酸(含量99.4%，批號：40124)，硫柳汞(含量99.2%，批號：40707)，均來源于德國Dr.Ehrenstorfer GmbH。甲醇、甲酸為色譜純市售試劑，其余試劑試藥為分析純；試驗用水為Milli-Q水。樣品為市售滴眼劑。

2 實驗方法

2.1 液相色譜-質譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1mm×100mm, 1.7μm)；柱溫：40℃；進樣量：10μL；流速：0.4mL/min；流動相A：含0.05%甲酸的2.5mmol/L醋酸銨溶液，流動相B：乙腈，梯度洗脫條件見表1。

離子源及掃描方式：電噴霧離子源(ESI)，負離子模式，多反應監(jiān)測(MRM)；電離電壓：3.5kV；離子源溫度：150℃；脫溶劑氣溫度：400℃；脫溶劑氣流量：550L/h(氮氣)；錐孔反吹氣流量：50L/h(氮氣)；碰撞室壓力：4.01×10-3mbar(碰撞氣為氬氣)[3-4]。6種抑菌劑MRM參數(shù)見表2。

表1 超高效液相色譜梯度洗脫條件Tab.1 Gradient mobile phase for UPLC

2.2 溶液配制

供試品溶液的制備：對于含尼泊金酯類的樣品，精密移取100μL，加水稀釋至50mL，搖勻，作為供試品溶液；對于含苯甲酸的樣品，精密移取100μL，加水稀釋至1mL，搖勻，作為供試品溶液；對于含山梨酸的樣品，精密移取100μL，加水稀釋至10mL，搖勻，作為供試品溶液；對于含硫柳汞的樣品，精密移取100μL，加水稀釋至1mL，搖勻，作為供試品溶液。

對照品溶液的制備：分別精密稱取6種抑菌劑對照品適量，加甲醇制成濃度約為1mg/mL的貯備液。分別精密量取羥苯甲酯、羥苯乙酯貯備液適量，加水稀釋，制成濃度為500、200、50、20、10和2ng/mL的標準曲線溶液；精密量取羥苯丙酯貯備液適量，加水稀釋，制成濃度為500、200、100、80、50和20ng/mL的標準曲線溶液；精密量取苯甲酸貯備液適量，加水稀釋，制成濃度為25、10、2.5、1、0.5和0.1μg/mL的標準曲線溶液；精密量取山梨酸貯備液適量，加水稀釋，制成濃度為100、40、10、4、2和0.4μg/mL的標準曲線溶液；精密量取硫柳汞貯備液適量，加水稀釋，制成濃度為10、8、5、2.5、1和0.75μg/mL的標準曲線溶液。

3 方法學驗證

3.1 專屬性試驗

取不含抑菌劑的空白樣品溶液，按“2.1”項下色譜質譜條件試驗，基質無干擾。另取不含抑菌劑的樣品作為空白溶液，加入適量羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、苯甲酸、山梨酸、硫柳汞對照品，按“2.1”項下色譜質譜條件試驗，在全掃描模式下的總離子流色譜圖見圖1，定量離子對MRM色譜圖見圖2。羥苯甲酯、苯甲酸、山梨酸保留時間約0.9min，羥苯乙酯保留時間約1.1min，羥苯丙酯保留時間約1.3min，硫柳汞保留時間約1.4min。在MRM模式下6種抑菌劑能良好分離，測定無干擾。

表2 6種抑菌劑MRM參數(shù)Tab.2 The parameters of MRM of six preservatives

3.2 線性與范圍

精密量取“2.2”項下標準曲線溶液各10μL，按“2.1”項下色譜質譜條件，注入超高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀，以峰面積(y)為縱坐標，濃度(x)為橫坐標，進行線性回歸。結果表明，羥苯甲酯、羥苯乙酯在0.002～0.5μg/mL范圍內、羥苯丙酯在0.02～0.5μg/mL范圍內、苯甲酸在0.1～25μg/mL范圍內、山梨酸在0.4～100μg/mL范圍內、硫柳汞在0.75～10μg/mL范圍內，峰面積與檢測濃度之間的線性關系良好(r≥0.995)(表3)。

圖1 空白樣品加標總離子流色譜圖Fig.1 TIC of the spiked sample

圖2 6種抑菌劑定量離子對MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of quantitative ion pairs of six preservatives

表3 6種抑菌劑線性結果Tab.3 The results of linear regression of six preservatives

3.3 回收率試驗

取不含抑菌劑的空白溶液9份，按“2.2”項下制備低、中、高3種濃度的溶液，各3份，按“2.1”項下色譜質譜條件，注入超高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀，依法測定，計算回收率，羥苯甲酯平均回收率100.0%(RSD=4.0%)、羥苯乙酯平均回收率103.8%(RSD=3.4%)、羥苯丙酯平均回收率94.7%(RSD=4.1%)、苯甲酸平均回收率96.8%(RSD=3.0%)、山梨酸平均回收率105.0%(RSD=4.1%)、硫柳汞平均回收率104.7%(RSD=2.3%)。

3.4 定量限

取不含抑菌劑的空白溶液，加入各對照品溶液適量，按“2.2供試品溶液的制備”項下操作，按“2.1”項下色譜質譜條件，注入超高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀，按信噪比S/N≥10計算定量限。帶入稀釋倍數(shù)后，滴眼劑樣品中羥苯甲酯、羥苯乙酯的定量限為1μg/mL；羥苯丙酯的定量限為10μg/mL；苯甲酸的定量限為1μg/mL；山梨酸的定量限為40μg/mL；硫柳汞的定量限為8μg/mL。

3.5 進樣重復性

取“2.2”項下各對照品溶液重復進樣6次，計算峰面積RSD。羥苯甲酯(進樣濃度0.2μg/mL)為1.1%；羥苯乙酯(進樣濃度0.2μg/mL)為2.1%；羥苯丙酯(進樣濃度0.2μg/mL)為2.1%；苯甲酸(進樣濃度10μg/mL)為1.5%；山梨酸(進樣濃度40μg/mL)為1.7%；硫柳汞(進樣濃度2.5μg/mL)為2.2%。

3.6 樣品測定

采用建立的方法對42批滴眼液進行檢測，測定結果見表4。

4 討論

相同濃度下，羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、苯甲酸、山梨酸在負離子模式下的響應均強于正離子模式，故選擇負離子模式進行檢測。硫柳汞分子量為405.99，失鈉后為383，本試驗以[M-Na]-為母離子采用負離子模式進行分析。

本次試驗樣品批次中有35%樣品未標示抑菌劑種類，標示抑菌劑種類的樣品中有29%無抑菌劑標示量。而中國藥典2015年版四部[1]和美國藥典[5]均要求多劑量眼用制劑應在產品標簽標明抑菌劑種類和標示量。由此可見應加強規(guī)范企業(yè)說明書。

本次試驗中發(fā)現(xiàn)部分滴眼液中抑菌劑實測百分含量偏低，分析原因可能是在長期放置過程中抑菌劑存在降解的可能，導致抑菌劑檢出含量低于標示量。這也與企業(yè)在滴眼劑長期穩(wěn)定性研究中往往關注含量測定與有關物質檢查等，未重視抑菌劑穩(wěn)定性研究相關。

表4 樣品測定結果Tab.4 The results of sample determination