黃建華

（南通大學(xué)附屬中學(xué) 江蘇南通 226019）

1 試題深藏奧秘

2009年江蘇高考卷的34題以農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法培育轉(zhuǎn)毒素蛋白基因的植物為背景，考查基因工程的相關(guān)知識(shí)，其基本過程如圖1所示。

圖1 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法培育轉(zhuǎn)Bt毒素蛋白基因的植物

圖1過程采用轉(zhuǎn)移法，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，再與Ti質(zhì)粒重組為共整合載體，然后轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。共整合載體是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)中的一種。這與高中教材介紹的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法不一樣，人教版高中教材介紹的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法是將目的基因插入到農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T－DNA中構(gòu)成重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌，通過農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用，將目的基因插入到植物細(xì)胞染色體DNA中，其過程如圖2所示。

圖2 人教版教材中所示的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

高中教材介紹的僅是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的思路，并不是具體操作步驟，而試題將教材中的轉(zhuǎn)化思路具體為轉(zhuǎn)化步驟，揭秘了質(zhì)粒載體系統(tǒng)的構(gòu)建、結(jié)合轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移質(zhì)粒等，以期讓教師和學(xué)生通曉真實(shí)的操作過程，拓寬認(rèn)知的視野。

2 構(gòu)建Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)的原由

2.1 農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定不能用單一載體運(yùn)載目的基因轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞

農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒中有T-DNA（包含生長素基因、細(xì)胞分裂素基因、冠癭堿合成基因）、冠癭堿代謝基因、復(fù)制起始位點(diǎn)、基因，其結(jié)構(gòu)如圖3所示。

圖3 農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖

T-DNA的轉(zhuǎn)移功能與其兩端25 bp的末端重復(fù)順序有關(guān)，特別是右邊界序列。農(nóng)桿菌把T-DNA整合到植物細(xì)胞核DNA上后，生長素基因和細(xì)胞分裂素基因的表達(dá)使植物細(xì)胞過度分裂、生長轉(zhuǎn)化為腫瘤；冠癭堿合成基因的表達(dá)使瘤細(xì)胞合成大量冠癭堿，供農(nóng)桿菌代謝利用，加速農(nóng)桿菌的繁殖，這是農(nóng)桿菌為自己巧妙設(shè)計(jì)的內(nèi)共生體系。但在培育轉(zhuǎn)基因植物時(shí)，導(dǎo)入外源生長素基因、細(xì)胞分裂素基因會(huì)打破內(nèi)源激素的平衡，阻礙受體植物細(xì)胞的脫分化和再分化；導(dǎo)入冠癭堿合成基因、冠癭堿代謝基因會(huì)消耗植物細(xì)胞的谷氨酸和精氨酸，影響植物細(xì)胞的生長。所以設(shè)計(jì)農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒運(yùn)載目的基因時(shí)，應(yīng)將這些基因去除。農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上沒有大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記基因，目的基因不能在大腸桿菌中保存和復(fù)制。并且，農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上一種限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)有多個(gè)，很難找到單一的酶切位點(diǎn)用于插入目的基因。這些因素都決定了Ti質(zhì)粒不能直接作為運(yùn)載目的基因的載體，必須要對(duì)Ti質(zhì)粒進(jìn)行改造，添加大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)、選擇標(biāo)記基因、多克隆位點(diǎn)后才能作為轉(zhuǎn)基因植物的載體。T-DNA的轉(zhuǎn)移需要基因表達(dá)產(chǎn)生的12種蛋白激活、協(xié)助，如構(gòu)建單一載體運(yùn)載目的基因轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。而基因高達(dá)40 kb，會(huì)增加載體的體積，降低導(dǎo)入農(nóng)桿菌成功率。所以，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中不采用單一載體運(yùn)載目的基因轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。

2.2 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的機(jī)制為構(gòu)建Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)提供了理論基礎(chǔ)

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的機(jī)制是：植物細(xì)胞分泌乙酰丁香酮（或羥基乙酰丁香酮）誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒上的基因以及農(nóng)桿菌染色體上的基因等10個(gè)基因的表達(dá)。這些基因的表達(dá)產(chǎn)物共同作用將T-DNA整合到植物細(xì)胞染色體DNA中。從農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的機(jī)制分析，基因的表達(dá)產(chǎn)物是成功轉(zhuǎn)化的必備條件，基因是否與T-DNA在同一質(zhì)粒上不是必備條件。所以，可在體外構(gòu)建攜帶目的基因、不攜帶基因的中間載體，農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒保留基因、去除非必須基因，然后將中間載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。這為構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)提供了理論基礎(chǔ)。

2.3 大腸桿菌與農(nóng)桿菌接合高效轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的特征為中間載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌供了方便

有的大腸桿菌細(xì)胞中含有轉(zhuǎn)移協(xié)助質(zhì)粒，含有轉(zhuǎn)移協(xié)助質(zhì)粒的大腸桿菌與農(nóng)桿菌接合，能將質(zhì)粒高效的轉(zhuǎn)移入到農(nóng)桿菌中。若大腸桿菌中同時(shí)含有中間載體和轉(zhuǎn)移協(xié)助質(zhì)粒則采用接合轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移中間載體，即把大腸桿菌和農(nóng)桿菌一起培養(yǎng)，大腸桿菌通過與農(nóng)桿菌的直接接合將中間載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中（轉(zhuǎn)移協(xié)助質(zhì)粒也一起轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中）。若大腸桿菌中有中間載體、沒有轉(zhuǎn)移協(xié)助質(zhì)粒，則采用三親雜交轉(zhuǎn)移法，即把含有中間載體的大腸桿菌、含有轉(zhuǎn)移協(xié)助質(zhì)粒的大腸桿菌、農(nóng)桿菌混合培養(yǎng)，通過雜交使轉(zhuǎn)移協(xié)助質(zhì)粒先轉(zhuǎn)移到含有中間載體的大腸桿菌中，然后通過與農(nóng)桿菌結(jié)合將中間載體轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌中。這樣就簡化從大腸桿菌中提取質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌的步驟了，現(xiàn)常用的方法是三親雜交轉(zhuǎn)移法。

3 Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)的類型

由兩種或兩種以上的質(zhì)粒構(gòu)成的復(fù)合型載體稱為載體系統(tǒng)，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法主要有兩種載體系統(tǒng)：一元載體系統(tǒng)和雙元載體系統(tǒng)。

3.1 一元載體系統(tǒng)

這類載體是中間載體與農(nóng)桿菌內(nèi)改造的Ti質(zhì)粒通過同源重組形成一種復(fù)合型載體。農(nóng)桿菌內(nèi)改造后的Ti質(zhì)粒也稱為受體Ti質(zhì)粒。根據(jù)同源重組序列的不同可分為共整合載體和拼接末端載體（也稱TDNA邊界拼接載體）。

3.1.1 共整合載體

共整合載體系統(tǒng)中的中間載體由E.Coli質(zhì)粒改造而來，其中含有大腸桿菌的復(fù)制原點(diǎn)、細(xì)菌的選擇基因、植物選擇標(biāo)記基因、目的基因、pBR322序列；受體Ti質(zhì)粒含有農(nóng)桿菌的復(fù)制原點(diǎn)、基因、T-DNA的左右邊界、pBR322序列（位于T-DNA的左右邊界之間）。當(dāng)中間質(zhì)粒導(dǎo)入含受體Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌后，中間質(zhì)粒和受體Ti質(zhì)粒通過pBR322序列進(jìn)行同源重組，中間載體整合到受體Ti質(zhì)粒的T-DNA中形成共整合質(zhì)粒（圖4）。中間載體不能在農(nóng)桿菌中復(fù)制，不能穩(wěn)定遺傳而消失。共整合質(zhì)粒既能在農(nóng)桿菌中復(fù)制，又帶有細(xì)菌選擇基因，所以含有共整合質(zhì)粒的農(nóng)桿菌能在選擇培養(yǎng)基中生長，可以被篩選出來。含共整合質(zhì)粒的農(nóng)桿菌細(xì)胞中含有T-DNA（目的基因）、基因和基因，所以這樣的農(nóng)桿菌可用于植物的轉(zhuǎn)化。

圖4 形成共整合質(zhì)粒的過程示意圖

3.1.2 拼接末端載體（T-DNA邊界拼接載體）

拼接末端載體的中間載體含有大腸桿菌的復(fù)制原點(diǎn)、細(xì)菌和選擇基因、T-DNA的右邊界、植物選擇標(biāo)記基因、目的基因、T-DNA的左邊界內(nèi)部序列；受體Ti質(zhì)粒含有農(nóng)桿菌的復(fù)制原點(diǎn)、基因、T-DNA的左邊界內(nèi)部序列、T-DNA的左邊界。當(dāng)中間質(zhì)粒導(dǎo)入含受體Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌后，中間質(zhì)粒和受體Ti質(zhì)粒通過T-DNA的左邊界內(nèi)部序列同源重組，形成拼接末端載體（圖5）。含拼接末端載體的農(nóng)桿菌含有選擇基因、T-DNA（目的基因）、基因和基因，能在選擇培養(yǎng)基中生長，可用于植物的轉(zhuǎn)化。

圖5 拼接末端載體的形成示意圖

共整合載體和拼接末端載體系統(tǒng)的中間載體、受體Ti質(zhì)粒、同源序列不同。共整合載體轉(zhuǎn)化的植物中帶有重復(fù)的pBR322序列，這可能會(huì)影響轉(zhuǎn)化植物中目的基因的穩(wěn)定性，而拼接末端載體不存在這種可能性，所以拼接末端載體的轉(zhuǎn)化更有效。

3.2 雙元載體系統(tǒng)

雙元載體系統(tǒng)由兩個(gè)分別含T-DNA和基因的Ti質(zhì)粒構(gòu)成，含T-DNA的Ti質(zhì)粒稱為微型Ti質(zhì)粒。微型Ti質(zhì)粒含大腸桿菌的復(fù)制原點(diǎn)、農(nóng)桿菌的復(fù)制原點(diǎn)，細(xì)菌選擇基因、完整的T-DNA（帶有目的基因和植物選擇標(biāo)記基因），含基因的Ti質(zhì)粒為協(xié)助Ti質(zhì)粒，如圖6所示。

圖6 雙元載體系統(tǒng)示意圖

最常用的含協(xié)助Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌是農(nóng)桿菌LBA4404，導(dǎo)入微型Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404就具有了轉(zhuǎn)化植物的能力。雙元載體系統(tǒng)中的2個(gè)質(zhì)粒不含同源序列，分子量較小，體外易操作，不需要進(jìn)行同源重組，T-DNA較小，轉(zhuǎn)化效率較高，但雙元載體構(gòu)建成功后，工程菌的穩(wěn)定性較差，容易丟失。