姚楠 張萬江

結(jié)核病是長期危害人類健康的嚴(yán)重傳染病之一，全球每年因肺結(jié)核死亡的患者超出300萬例之多。我國是世界上22個結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，現(xiàn)有結(jié)核病患者約500萬例，僅次于印度，居世界第2位。據(jù)WHO估算全球有近1／3的人群感染結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb），而其中僅10%發(fā)展為活動性結(jié)核病，大多數(shù)轉(zhuǎn)變?yōu)闈摲腥?，此時Mtb多以休眠菌形式存在［1］。但近年來由于人口增加、流動人口增多、耐藥Mtb增多、農(nóng)村醫(yī)療條件差，以及個體免疫力低下等原因使活動性結(jié)核病的比率大幅度提高，故研究結(jié)核發(fā)病機(jī)制的分子基礎(chǔ)至關(guān)重要。

Mtb的休眠狀態(tài)

Mtb的休眠狀態(tài)是指Mtb可以在體內(nèi)形成一種持續(xù)存在的狀態(tài)，在這種狀態(tài)下，細(xì)菌生長極為緩慢，細(xì)菌的酶活性降低從而使細(xì)菌的代謝路徑改變，同時蛋白合成改變，總蛋白的合成減少，細(xì)胞壁增厚，出現(xiàn)大量的16kD小熱休克蛋白［2］。

McCune等［3］于20世紀(jì)50年代首先提出結(jié)核休眠菌（dormant tubercle bacilli）的概念，在其設(shè)計(jì)的Cornell模型中用大劑量Mtb毒株感染小鼠，疾病自然進(jìn)展2周，然后用異煙肼（INH）和吡嗪酰胺（PZA）聯(lián)合化療12周后，取小鼠的肺和脾臟組織培養(yǎng)無Mtb生長。倘若不給予進(jìn)一步治療，間隔一段時間可見Mtb又重新出現(xiàn)在這些組織，由此McCune等認(rèn)為這些組織中可能存在休眠狀態(tài)的Mtb。Wayne等［4］于1994年提出結(jié)核休眠菌是殘存在人體單核巨噬細(xì)胞內(nèi)極微量，處于代謝靜止期的Mtb。這些休眠菌可在體內(nèi)持續(xù)存在數(shù)月至數(shù)年而機(jī)體沒有不適或臨床癥狀，當(dāng)機(jī)體免疫力降低時結(jié)核休眠菌又開始生長繁殖，導(dǎo)致疾病發(fā)生，出現(xiàn)臨床癥狀，這是近年來結(jié)核病發(fā)病率回升的主要因素之一。

在Wayne等［4］制作的體外“休眠”模型中，Mtb在氧氣缺乏的情況下形成了一種厭氧、耐藥和不能復(fù)制的狀態(tài)，認(rèn)為生長繁殖期Mtb向休眠期Mtb轉(zhuǎn)變過程中可能存在某些酶的改變，使其代謝模式向乙醛酸旁路或其他旁路轉(zhuǎn)變，從而適應(yīng)休眠狀態(tài)。感染機(jī)體的Mtb可能有處于休眠狀態(tài)，因此休眠狀態(tài)Mtb在人體內(nèi)是普遍存在的。

Mtb休眠機(jī)制及相關(guān)因素

一、Mtb休眠生物學(xué)機(jī)制

隨著人們對潛伏感染的認(rèn)識，休眠期Mtb表達(dá)的抗原物質(zhì)開始受到重視。體內(nèi)潛伏感染Mtb可通過改變基因或蛋白的表達(dá)而適應(yīng)不同的外部環(huán)境，從而在Mtb感染的不同階段產(chǎn)生相應(yīng)的不同的抗體［5］。休眠期 Mtb為了適應(yīng)缺氧等惡劣生存環(huán)境，使得部分基因表達(dá)上調(diào)。Mtb還通過抑制Ca2＋依賴性Ⅲ型磷脂酰肌醇3－激酶（Phosphoinositide 3－kinase，PI3K）：hVps34p級聯(lián)反應(yīng)，抑制吞噬體成熟，從而利于其寄生胞內(nèi)［6］。在低氧和NO作用的環(huán)境中，休眠相關(guān)DosR調(diào)節(jié)子（包括48個基因）和HspX（Q－crystallin）基因表達(dá)上調(diào)［7］，部分上調(diào)表達(dá)的因子有抗原性［8］。其中，HspX抗原可以被致敏的T細(xì)胞識別，刺激T細(xì)胞分泌γ干擾素（IFN－γ），具有細(xì)胞免疫和體液免疫原性［8］。目前比較明確的與Mtb休眠有關(guān)的抗原包括小分子熱休克蛋白（small heat shock proteins，sHSPs）Hspl6.3、阿拉伯－甘露醇聚糖脂（lipoarabinomnnan，LAM）和異檸檬酸裂解酶（Isocitrate Lyase，ICL）［5］。

二、Mtb休眠與“泡沫”巨噬細(xì)胞（“foamy”macrophage）

泡沫細(xì)胞是由于多種原因?qū)е录?xì)胞內(nèi)脂質(zhì)大量聚集形成的，主要來源于巨噬細(xì)胞［9］。近期有休眠模型研究表明，“泡沫”巨噬細(xì)胞的形成可能是 Mtb感染持續(xù)性的關(guān)鍵［10］，該模型在體外模擬人類免疫反應(yīng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Mtb可引導(dǎo)免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)型為“泡沫”細(xì)胞，轉(zhuǎn)化為“泡沫”細(xì)胞的巨噬細(xì)胞會喪失殺菌能力，轉(zhuǎn)型為一種非攻擊型狀態(tài)，且在細(xì)胞內(nèi)累積大量的脂質(zhì)，Mtb借此逃避宿主的免疫攻擊同時獲得大量的營養(yǎng)成分。Mtb在這些細(xì)胞可持續(xù)存活，隨后進(jìn)入休眠狀態(tài)。

三、Mtb相關(guān)蛋白

（一）小分子熱休克蛋白（Hsp16.3）

Mtb小分子熱休克蛋白Hsp16.3是近年研究發(fā)現(xiàn)的存在于Mtb膜上的一個主要抗原蛋白，由144個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為16.277kD，等電點(diǎn)為4.85，序列分析表明它屬于sHsps家族［11-13］。有研究表明，Hsp16.3 可能與Mtb潛伏感染中體眠菌的形成有關(guān)［14］，該蛋白具有人和鼠的T細(xì)胞識別表位，并能誘導(dǎo)一定的細(xì)胞免疫應(yīng)答，可能是Mtb潛伏性感染時的靶抗原［15］。

同時，Mtb進(jìn)入宿主巨噬細(xì)胞時可大量表達(dá)Hsp16.3，對其在宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)長期生長、繁殖和致病性都起重要作用［11］。Cunningham等［16］用轉(zhuǎn)換電鏡觀察到無氧條件下的Mtb休眠菌細(xì)胞壁增厚現(xiàn)象，同時用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）法測得休眠狀態(tài)下16kD小分子熱休克蛋白高度表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)該蛋白與細(xì)胞壁增厚以及纖維肽多糖結(jié)構(gòu)有關(guān)，認(rèn)為細(xì)胞壁增厚和16kD小分子熱休克蛋白的高度表達(dá)是Mtb能以休眠狀態(tài)長期存在的主要原因。當(dāng)Mtb在體內(nèi)進(jìn)入巨噬細(xì)胞或在厭氧環(huán)境培養(yǎng)時，存在于細(xì)胞質(zhì)膜上的主要抗原Hsp 16.3會迅速大量表達(dá)，最多可達(dá)到整個菌體蛋白的25%，Mtb細(xì)胞壁增厚，以適應(yīng)長期潛伏生長的需要［16］。

另有研究表明，Hsp16.3不僅有助于 Mtb細(xì)胞膜的增厚，以及增強(qiáng)Mtb抵抗脅迫環(huán)境的能力，如NO、氧自由基、缺氧等不利因素的影響等，而且同時可以使Mtb在宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)的生長狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殪o止，有助于Mtb在宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)滯留，長期生長繁殖［17］。

（二）LAM

LAM是一種非蛋白 Mtb抗原，屬多糖，具有較強(qiáng)的免疫原性，能夠刺激Mtb感染者產(chǎn)生抗體。有文獻(xiàn)報(bào)道，Mtb感染宿主細(xì)胞后可引起絲裂原活化的蛋白激酶（mitogen－activated protein kinase，MAPK）通路、PI3K／Akt通路和連接蛋白－信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子（just another kinase，JAK）／（signal transducer and activator of transcription，STAT）通路等多條相關(guān)信號傳導(dǎo)通路的激活或抑制［18］。人體細(xì)胞受到Mtb刺激后，經(jīng)三級激酶級聯(lián)反應(yīng)MAPKKK→MAPKK→MAPK，在MAPKK處激活應(yīng)激活化的蛋白激酶（Stress－activated protein kinases，SAPK）／c－Jun氨基端激酶（C－Jun N－terminal kinases，JNK），p38MAPK和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）3 條 不 同 的MAPK支路［19］。有研究表明LAM可促進(jìn)SAPK去磷酸化及ERK酪氨酸磷酸化過程，抑制神經(jīng)酰胺（ceramide）的產(chǎn)生，有抗凋亡作用，使宿主細(xì)胞能夠在感染狀態(tài)下繼續(xù)存活，抵抗巨噬細(xì)胞的殺滅作用［18，20］。其機(jī)制可能為：（1）清除具有細(xì)胞毒性的氧自由基；（2）抑制蛋白激酶C的活性；（3）阻斷IFN－γ誘導(dǎo)的人巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞系的基因轉(zhuǎn)錄；（4）誘導(dǎo)TNF－α的生成［21］。其中，TNF－α是參與炎癥誘導(dǎo)和肉芽腫形成等宿主早期免疫反應(yīng)的主要免疫因子之一，但Roach等［22］發(fā)現(xiàn)無毒株 H37Ra的LAM 可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞合成TNF－α，而有毒株Erdman的LAM不能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞合成TNF－α，從而認(rèn)為LAM是有毒株Mtb能在巨噬細(xì)胞內(nèi)持續(xù)存在的原因之一。

（三）ICL

ICL為Mtb乙醛酸循環(huán)途徑的關(guān)鍵酶之一，催化異檸檬酸裂解為琥鉑酸和乙醛酸。處于潛伏感染狀態(tài)下的Mtb主要通過乙醛酸循環(huán)途徑代謝脂肪酸維持生存。李俊明等［23］研究認(rèn)為異檸檬酸裂解酶通過抑制宿主細(xì)胞的凋亡可能是增強(qiáng)胞內(nèi)存活的相關(guān)重要機(jī)制之一。ICL以前被證實(shí)在Mtb的細(xì)胞內(nèi)新陳代謝中扮演著關(guān)鍵的角色，當(dāng)Mtb處于潛伏狀態(tài)或被巨噬細(xì)胞吞噬后，其ICL的表達(dá)水平顯著升高［24］。

四、Mtb休眠的基因基礎(chǔ)

有研究表明大多數(shù)活動性結(jié)核是潛伏感染的Mtb重新被激活所致［25］。休眠狀態(tài)Mtb復(fù)蘇基因的啟動是休眠M(jìn)tb復(fù)蘇的關(guān)鍵，阻斷復(fù)蘇基因啟動，讓休眠M(jìn)tb永遠(yuǎn)“沉睡”是防止結(jié)核病復(fù)燃的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

目前研究發(fā)現(xiàn)，與Mtb休眠相關(guān)的基因有二碳代謝基因、核糖蛋白合成下調(diào)基因及膠原基質(zhì)合成基因等［26］。也有研究表明，維生素D的代謝產(chǎn)物可活化巨噬細(xì)胞，抑制Mtb活性，且維生素D受體（VDR）基因可通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的吞噬作用和殺菌活性，影響Mtb在胞內(nèi)的存活狀態(tài)，可能會對肺結(jié)核復(fù)發(fā)有一定影響［27］。

1996年DeMaio等［28］用PCR法從 Mtb中克隆出一種Sigma因子基因（SigF），其編碼的蛋白與藍(lán)鏈絲菌和枯草桿菌的芽孢形成因子（SigF）及枯草桿菌的應(yīng)激反應(yīng)因子（SigB）相似，其mRNA在牛結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的穩(wěn)定期、氮耗竭期、冷休克時可大量表達(dá)，但在對數(shù)期不表達(dá)，在對數(shù)期后、氧化應(yīng)激時、無氧和酒精性休克時少量表達(dá)。因此有學(xué)者認(rèn)為，SigF基因的高表達(dá)在Mtb適應(yīng)休眠狀態(tài)和抵抗宿主防御反應(yīng)中有一定的作用［29］。devR基因和ATP合成下調(diào)基因也是維持Mtb休眠狀態(tài)的必需基因［30］。如果將這些休眠維持基因作為分子靶位，改變其表達(dá)方式或是結(jié)果，從而改變休眠菌的生存條件，將是防止結(jié)核病復(fù)燃的有效途徑。

休眠菌復(fù)蘇機(jī)制及相關(guān)因子

潛伏的休眠菌如何終止休眠也是目前主要的研究領(lǐng)域之一。復(fù)活促進(jìn)因子（Rpf）是休眠菌終止休眠的重要因素之一，最早在藤黃微球菌（Micrococcus luteus）中發(fā)現(xiàn)，是一種抗休眠因子，可以促進(jìn)休眠期 Mtb的生長［31］。Biketov等［32］研究巨噬細(xì)胞內(nèi)Mtb的分離培養(yǎng)時則發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞內(nèi)Mtb由于菌體受到損傷或處于休眠狀態(tài)，其在體外生長困難，所測的單位體積內(nèi)細(xì)菌形成單位（CFU）明顯低于實(shí)際細(xì)菌濃度，當(dāng)加入Rpf后可促進(jìn)受損傷菌體或處于休眠狀態(tài)菌體的復(fù)蘇和生長，生長數(shù)量明顯增加，敏感度增高。

Mtb中存在5種功能部分重疊的Rpf樣蛋白，即RpfA、RpfB、RpfC、RpfD和 RpfE。Kana等［33］證明在 Mtb生長中5種基因都是非必需的，遺傳互補(bǔ)或加入野生型Mtb培養(yǎng)基濾液可以使休眠菌恢復(fù)正常生長，并且還發(fā)現(xiàn)RpfB和RpfE在功能上比RpfD更重要。Hett等［34］利用酵母雙雜交鑒定了一種能夠與RpfB結(jié)合的伴侶蛋白分子，它是一種Mtb內(nèi)肽酶，稱作Rpf相互作用蛋白A（RipA）。它們之間的相互作用是通過體內(nèi)和體外的共沉淀實(shí)驗(yàn)確定的，相互作用的結(jié)構(gòu)域在2個蛋白的C端，靠近溶菌酶結(jié)構(gòu)域。RipA是一種與細(xì)胞膜結(jié)合的分泌蛋白，也是一種肽聚糖水解酶，能夠水解細(xì)胞壁，與RpfB在同一個細(xì)胞腔隙中，熒光顯微檢測表明兩者都定位在活動性Mtb的隔膜上。2種肽聚糖水解酶之間的相互作用，暗示它們的復(fù)合物在細(xì)胞分裂中起作用，也可能在休眠菌復(fù)活中起作用。

結(jié) 語

目前我國的結(jié)核病現(xiàn)狀仍不容樂觀，需對結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行更深入的研究。而目前認(rèn)為休眠M(jìn)tb是導(dǎo)致結(jié)核菌潛伏感染的重要因素之一，休眠M(jìn)tb復(fù)蘇基因的啟動是影響其復(fù)蘇的關(guān)鍵，這一機(jī)制的啟動將涉及多條復(fù)雜的細(xì)胞信號通路及若干復(fù)蘇基因，若能尋求一種途徑阻止細(xì)胞信號通路的傳導(dǎo)或干擾復(fù)蘇基因的表達(dá)，讓休眠M(jìn)tb永遠(yuǎn)沉睡，將對降低結(jié)核病的復(fù)發(fā)率，繼而從根本上消除結(jié)核病具有重要意義。而如何阻斷其進(jìn)入休眠狀態(tài)和殺滅結(jié)核休眠菌仍需進(jìn)一步研究。

［1］Nair N，Cooreman E.Working towards TB elimination the WHO Regional strategic Plan（2006—2015）.J Commum Dis，2006，38（3）：185－190.

［2］Rustad TR，Sherrid AM，Minch KJ，et al.Hypoxia：a window into Mycobacterium tuberculosis latency.Cell Microbiol，2009，11（8）：1151－1159.

［3］Mccune RM Jr，Mcdermott W，Tompsett R.The fate of Mycobacterium tuberculosis in mouse tissues as determined by the microbial enumeration technique.II.The conversion of tuberculous infection to the latent state by the administration of pyrazinamide and a companion drug.J Exp Med，1956，104（5）：763－802.

［4］Wayne LG.Dormancy of Mycobacterium tuberculosis and latency of disease.Eur J Clin Microbiol Infect Dis，1994，13（11）：908－914.

［5］郭利民，張廷芬，師長宏，等.結(jié)核分枝桿菌潛伏性感染的診斷.醫(yī)學(xué)雜志研究，2009，38（4）：7－9.

［6］Vergne I，Chua J，Deretic V.Tuberculosis toxin blocking phagosome maturation inhibits a novel Ca2＋／calmodulin－PI3K hVPS34cascade.J Exp Med，2003，198（4）：653－659.

［7］Park HD，Guinn KM，Harrell MI，et a1.Rv3133c／dosR is a transcription factor that mediates the hypoxic response of Myeobacterium tuberculosis.Mol Microbiol，2003，48（3）：833－843.

［8］李青，姜雯雯，雒彧，等.結(jié)核分枝桿菌抗原Ag85B－Mpt64190－198－HspX融合蛋白免疫原性的初步觀察.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2009，29（2）：103－107.

［9］蘇華，付玲，朱紅艷，等.腎小球疾病間質(zhì)泡沫細(xì)胞的分布及其臨床病理意義.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2009，25（6）：606－609.

［10］Peyron P，Vaubourgeix J，Poquet Y，et al.Foamy Macrophages from Tuberculous Patients’Granulomas Constitute a Nutrient－Rich Reservoir for M.tuberculosis Persistence.PLoS Pathog，2008，4（11）：e1000204.

［11］Fu X，Jiao W，Chang Z.Phylogenetic and biochemical studies reveal a potential evolutionary origin of small heat shock proteins of animals from bacterial class A.J Mol Evol，2006，62（3）：257－266.

［12］Chen X，F(xiàn)u X，Ma Y，et al.Chaperone－like activity of Mycobacterium tuberculosis Hsp16.3does not require its intact（native）structures.Biochemistry （Mosc），2005，70（8）：913－919.

［13］Fu X，Chang Z.Identification of a highly conserved pro－gly doublet in non－animal small heat shock proteins and characterization of its structural and functional roles in Mycobacterium tuberculosis Hsp 16.3.Biochemistry，2006，71（1）：68－73.

［14］劉忠華，丁元生，畢愛笑，等.結(jié)核分枝桿菌38kD－16kD融合蛋白克隆表達(dá)及血清學(xué)診斷價(jià)值.中國防癆雜志，2009，31（10）：565－568.

［15］Geluk A，Lin MY，van Meijgaarden KE，et al.T－cell recongnition of the HspX protein of Mycobacterial tuberculosis correlates with latent M.tuberculosis infection but not with M.bovis BCG vaccination.Infect Immun，2007，75（6）：2914－2921.

［16］Cunningham AF，Spreadbury CL.Mycobacterial tionary phasee induced by low oxygen tension：cell wall thickening and localization of the 16－kilodalton alpha－crystallin homlog.J Bacteriol，1998，180（4）：801－808.

［17］Wang Z，Cao AN，Lai LH.High activity of Mj HSP 16.5under acidic condition.Sci China Ser B，2009，52（3）：325－331.

［18］Sirkar M，Majumdar S.Lipoarabinomannan－induced cell signaling involves ceramide and mitogen－activated protein kinase.Clin Diagn Lab Immunol，2002，9（6）：1175－1182.

［19］Song CH，Lee JS，Lee SH，et al.Role of mitogen－activated protein kinase pathways in the production of tumor necrosis factor－alpha，interleukin－10，and monocyte chemotactic protein－1by Mycobacterium tuberculosis H37Rv－infected human monocytes.J Clin Immunol，2003，23（3）：194－201.

［20］孫遜，蔣超英.結(jié)核蛋白芯片對肺結(jié)核球及肺門淋巴結(jié)結(jié)核與其他肺部占位病變的診斷價(jià)值.中國防癆雜志，2010，32（7）：405－407.

［21］Chan J，F(xiàn)an XD，Hunter SW，et al.Lipoarabinomannan，a possible virulence factor involved in persistence of Mycobacterium tuberculosis within macrophages.Infect Immun，1991，59（5）：1755－1761.

［22］Roach TI，Barton CH，Chatterjee D，et al.Macrophage activation：lipoarabinomannan from avirulent and virulent strains of Mycobacterium tuberculosis differentially induces the early genes c－fos，KC，JE，and tumor necrosis factor－alpha.J Immunol，1993，150（5）：1886－1896.

［23］Li JM，Li N，Zhu DY，et al.Isocitrate lyase from Mycobacteria tuberculosis promotes survival of Mycobacterium smegmatis within macrophage by suppressing cell apoptosis.Chin Med J（Engl），2008，121（12）：1114－1119.

［24］Graham JE，Clark－Curtiss JE.Identification of Mycobacterium tuberculosis RNAs synthesized in response to phagocytosis by human macrophages by selective capture of transcribed sequences（SCOTS）.Proc Natl Acad Sci U S A，1999，96（20）：11554－11559.

［25］Shiloh MU，DiGiuseppe Champion PA.To catch a killer.What can mycobacterial models teach us about Mycobacterium tuberculosis pathogenesis？Curr Opin Microbio，2010，13 （1）：86－92.

［26］羅開軍，石君，王曉紅，等.結(jié)核分枝桿菌休眠期和活躍期差異表達(dá)基因分析.中國病原生物學(xué)雜志，2010，（12）：889－895.

［27］劉一典，肖和平，沙巍，等.新發(fā)和復(fù)發(fā)肺結(jié)核維生素D受體基因多態(tài)性分布.中國感染與化療雜志，2008，（04）：289－292.

［28］DeMaio J，Zhang Y，Ko C，et al.A stationary－phase stress－response sigma factor from Mycobacterium tuberculosis.Proc Natl Acad Sci U S A，1996，93（7）：2790－2794.

［29］袁群英.抗結(jié)核病藥物治療的研究進(jìn)展.臨床肺科雜志，2010，（05）：701－703.

［30］Murphy DJ，Brown JR.Identification of gene targets against dormant phase Mycobacterium tuberculosis infection.BMC Infect Dis，2007，7：84.

［31］Mukamolova GV，Turapov OA，Kazarian K，et a1.The rpf gene of Micrococcus luteus encodes an essential secreted growth factor.Mol Microbiol，2002，46（3）：611－621.

［32］Biketov S，Potapov V，Ganina E，et al.The role of resuscitation promoting factors in pathogenesis and reactivation of Mycobacterium tuberculosis during intra－peritoneal infection in mice.BMC Infect Dis，2007，7：146.

［33］Kana BD，Gordhan BG，Downing KJ，et al.The resuscitationpromoting factors of Mycobacterium tuberculosis are required for virulence and resuscitation from dormancy but are collectively dispensable for growth in vitro.Mol Microbiol，2008，67（3）：672－684.

［34］Hett EC，Chao MC，Steyn AJ，et al.A partner for the resuscitation－promoting factors of Mycobacterium tuberculosis.Mol Microbiol，2007，66（3）：658－668.