王風波, 李曉捷, 唐明薇

腦源性神經(jīng)生長因子(brain-derived neuotrophic factor,BDNF)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、抵抗傷害性刺激的能力、促使神經(jīng)元損傷后修復等方面均具有重要的作用,對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病及損傷的治療有著極高的價值和前景。研究顯示,BDNF蛋白表達升高的時間與腦損傷的治療窗相吻合,BDNF陽性表達水平亦隨著腦的發(fā)育而變化,并與腦損傷有直接的關系[1]。目前已有研究證據(jù)顯示,電針可上調(diào)腦內(nèi)BDNF的表達水平,促進損傷及壞死灶周圍正常神經(jīng)元軸突芽生,使新的突觸形成,并減少神經(jīng)元凋亡[2]。本實驗正是基于上述研究成果和理論依據(jù),采用宮內(nèi)感染致仔鼠腦損傷模型,用陽性細胞計數(shù)方法來觀察腦的皮質區(qū)BDNF陽性表達情況,進而研究宮內(nèi)感染對仔鼠的各時期腦組織BDNF陽性表達影響,推測早期電針干預提高神經(jīng)可塑性和損傷后修復的物質基礎及可能機制,為臨床治療提供客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級成熟W istar大鼠60只,雌性40只,雄性20只,體質量≥220 g,由佳木斯大學實驗動物中心(合格證號:黑動字D99102001號)提供。

1.2 實驗試劑 脂多糖(血清型055∶B5,美國SIGMA公司);羊抗兔BDNF多克隆抗體、SABC試劑盒、DAB顯色液等(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3 腦損傷模型制備 將雌、雄性大鼠室溫(21±1)℃下常規(guī)飼養(yǎng),自由飲食,明暗周期各半(12 h/12 h)。環(huán)境適應2周后,于17時雌雄比例以2∶1合籠,次日上午8時行陰道涂片檢查,查到精子為妊娠第0天,孕鼠另籠飼養(yǎng)。將31只孕鼠按隨機數(shù)表法分為生理鹽水組(n=6)和脂多糖組(n=25)。孕17 d的脂多糖組孕鼠給予脂多糖450μg/(kg·d),連續(xù)2 d腹腔注射,生理鹽水組孕鼠腹腔注射同等劑量的生理鹽水。孕22 d前分娩的仔鼠為早產(chǎn)鼠,兩組均去除早產(chǎn)鼠。仔鼠出生后取胎盤做蘇木精-伊紅染色觀察宮內(nèi)感染情況,判斷標準為大量中性粒細胞浸潤。

1.4 分組方法 按隨機數(shù)表法選取生理鹽水組仔鼠32只為對照組,脂多糖組仔鼠56只;脂多糖組仔鼠再按隨機數(shù)表法分為非干預組32只,電針組24只。

1.5 干預方法 電針組仔鼠7日齡開始進行電針干預,每日1次,干預至28日齡。選取百會、曲池及足三里為干預穴位,參照《實驗針灸學》[3]及王琴玉等[4,5]方法,具體操作是:結合人與動物骨度類比,頂骨正中定百會;橈骨近端的關節(jié)外側前方凹陷中取曲池;膝關節(jié)后外側之腓骨小頭下約5mm處取足三里。以直徑0.2 mm、長20mm的華佗牌針灸針,平刺入百會,進針后覺針下沉緊即可。各穴均連接至電針儀,連續(xù)波,頻率5～10 H z,強度以頭部輕微抖動為度,一般3～5 V,持續(xù)10 min。對照組、非干預組仔鼠均常規(guī)飼養(yǎng)。

1.6 觀察指標 對照組和非干預組仔鼠于24 h各處死8只行腦組織病理學、BDNF表達檢測。各組分別于14、21、28日齡行腦組織BDNF表達檢測。

1.7 腦組織BDNF檢測 采用SABC免疫組織化學染色法,陰性對照用磷酸鹽緩沖液代替一抗。BDNF陽性細胞判定標準:棕黃色免疫陽性顆粒主要分布在胞漿和細胞膜表面,主干樹突和近細胞膜的胞漿處染色較深,而胞體中央細胞核處染色較淺。每例腦組織于皮質區(qū)取4張切片,每張切片在顯微鏡(×400)下隨機取4個相互不疊加視野,計數(shù)陽性細胞。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理,計量資料以 x±s表示,組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 胎盤病理改變及新生仔鼠腦組織病理改變 與對照組仔鼠相比,脂多糖組仔鼠出生后顏色青紫、活動少、肌肉顫動、翻身不能等。脂多糖組孕鼠胎盤病理檢測,可見胎盤內(nèi)血管充血、水腫,大量中性粒細胞浸潤;對照組孕鼠胎盤病理檢測未見炎癥反應。脂多糖組仔鼠腦白質組織疏松,血管擴張,膠質細胞聚集,腦室內(nèi)出血等;對照組仔鼠腦白質結構完整有序,核仁清楚。

2.2 不同時期3組仔鼠腦組織BDNF陽性細胞檢測結果 對照組及非干預組仔鼠1日齡腦組織BDNF陽性反應皆欠均勻,陽性細胞數(shù)量少,胞漿著色相對較深,細胞輪廓模糊,突起染色欠佳,胞核無著色;非干預組BDNF陽性細胞計數(shù)3.147±0.776,多于對照組1.547±0.653,差異有統(tǒng)計學意義(F=23.48,P<0.01)。隨著日齡增加,各組仔鼠BDNF陽性細胞數(shù)量均逐漸增多,在21日齡達高峰,細胞輪廓漸清晰,染色增強,部分細胞可見淡染的短突起,28日齡呈下降趨勢;非干預組與對照組在各日齡BDNF陽性細胞計數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05);電針組在各日齡BDNF陽性細胞計數(shù)均明顯高于非干預組與對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組仔鼠不同日齡腦組織BDNF的陽性細胞計數(shù)比較( x±s,n=8)

3 討論

宮內(nèi)感染是導致新生兒腦損傷的重要致病因素,與腦性癱瘓密切相關。自胚胎18 d至生后25 d是大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的關鍵期,此期內(nèi)隨日齡增加,新生大鼠皮質神經(jīng)元內(nèi)的線粒體、粗面內(nèi)質網(wǎng)和游離核糖體等逐漸增多,腦在結構和功能上具有很強的可塑性。與人類相比,15日齡大鼠的腦發(fā)育水平與1周歲兒童相當,28～30日齡大鼠與2周歲兒童相當,而0～2歲是兒童腦發(fā)育的關鍵時期,中樞神經(jīng)系統(tǒng)逐漸發(fā)育成熟。在大腦皮質及海馬區(qū)分布廣泛的BDNF可提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的存活能力,改善受損神經(jīng)元的病理狀態(tài),促進其再生及分化成熟,因而可防止神經(jīng)元受損至死亡。在神經(jīng)元的發(fā)育、生長過程中,BDNF具有調(diào)節(jié)突觸傳遞,促進突觸生長和突觸重塑等作用,隨機體發(fā)育成熟其水平逐漸降低,并維持在較低水平。研究發(fā)現(xiàn),新生大鼠腦組織BDNF陽性表達在第20～25天達到高峰,之后呈遞減趨勢[1]。

本實驗結果顯示,在發(fā)育生長過程中,各組仔鼠腦組織BDNF的陽性反應均越來越強,陽性細胞計數(shù)越來越高,在21日齡達到高峰,28日齡呈下降趨勢,這與寧曉霞等[6]的研究結果基本一致。與對照組相比,1日齡非干預組BDNF陽性反應較強,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),此后兩組間在各日齡差異均無統(tǒng)計學意義,這與彭洪軍等[7]研究結果基本一致。不同日齡電針組仔鼠腦組織BDNF陽性細胞計數(shù)均明顯高于對照組和非干預組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。1日齡非干預組BDNF陽性反應強于對照組,可能與胎鼠的腦受損時間有關,表明宮內(nèi)感染所致腦損傷可刺激中樞神經(jīng)元及星形膠質細胞等合成、分泌BDNF增加,而后對腦損傷仔鼠進行的早期電針干預更明顯增強了腦組織BDNF的陽性反應,符合BDNF對中樞神經(jīng)元的營養(yǎng)、支持和受損后的修復作用。結合本實驗仔鼠腦組織蘇木精-伊紅染色病理檢查結果,更說明宮內(nèi)感染可導致仔鼠腦白質損傷。

宮內(nèi)感染造成仔鼠腦組織BDNF陽性反應增強可能是通過以下機制:(1)炎癥反應激活淋巴細胞、巨噬細胞產(chǎn)生的細胞因子能進一步激活胎盤血管內(nèi)皮細胞,促使微血栓形成,導致胎盤與胎兒間的血液循環(huán)障礙,使胎兒宮內(nèi)缺血、缺氧、腦內(nèi)能量代謝降低;(2)使大量細胞外Ca2+內(nèi)流和細胞內(nèi)Ca2+蓄積,致Ca2+超載;(3)透過血腦屏障進入胎兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥產(chǎn)物激活腦內(nèi)血管內(nèi)皮細胞,引起血管栓塞;(4)刺激神經(jīng)膠質細胞增生,表達細胞因子、一氧化氮、黏附分子等,產(chǎn)生級聯(lián)反應;(5)促進興奮性氨基酸釋放,以N-甲基門冬氨酸受體蛋白受體作中介,誘導神經(jīng)元凋亡。這些因素最終都能刺激中樞神經(jīng)元及星形膠質細胞等合成和分泌BDNF增加。

BDNF對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用可能是通過提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)對抗代謝性和興奮性氨基酸毒性損傷的能力,維持細胞內(nèi)Ca2+的水平,穩(wěn)定細胞內(nèi)環(huán)境,抵抗一氧化氮介導的谷氨酸細胞毒性,調(diào)節(jié)自由基代謝,減少自由基在神經(jīng)元內(nèi)的積聚。

針灸治療腦損傷及后遺癥歷史由來已久,療效毋庸置疑,對于穴位的選擇,中醫(yī)理論認為:百會穴屬督脈,統(tǒng)領一身陽氣,與腦關系密切,針灸督脈可補腦益髓;曲池、足三里屬陽明經(jīng)合穴,具醒腦開竅之效,針刺合穴可增強氣血運行,促進閉塞經(jīng)脈疏通,尤其適用于治療腦損傷致運動障礙。臨床實驗發(fā)現(xiàn),根據(jù)Brodm ann分區(qū),電針曲池穴可以激活同側初級軀體運動區(qū)、輔助運動區(qū)、雙側初級軀體感覺區(qū)及雙側額上回等中樞區(qū)域[8]。故選用針灸督脈百會穴及陽明經(jīng)合穴作為腦損傷治療方案,可以振奮周身之陽氣,疏經(jīng)通絡,補氣益血,提升氣血運行,促進肢體功能康復。電針治療集針刺與電刺激功效于一身,療效明顯優(yōu)于單純針刺或電刺激,是現(xiàn)代針灸學最常用之治療方法。

本實驗于第7日齡開始電針干預。實驗結果顯示,與對照組和非干預組相比,電針組仔鼠腦組織BDNF陽性細胞計數(shù)明顯增多,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),說明電針干預可以上調(diào)腦損傷動物腦組織BDNF表達水平,促進受損神經(jīng)的再生與修復。同時,電針組的BDNF陽性表達高峰同樣出現(xiàn)在21日齡,28日齡出現(xiàn)下降趨勢,與其他組表現(xiàn)趨勢一致。電針促使腦損傷后腦組織BDNF陽性反應增強。牛小梅[9]研究分析后認為其可能機制是:保護尼氏體使神經(jīng)元內(nèi)蛋白質較正常的合成,促使中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)處于活躍狀態(tài),增加內(nèi)源性保護因子的表達等。本實驗雖僅從BDNF角度觀察和研究電針對腦損傷的治療作用,但通過對已研究證實的BDNF生物學效應的分析,進一步證實了電針可通過提高BDNF等神經(jīng)營養(yǎng)因子水平進而增強腦損傷后的神經(jīng)修復功能,為臨床治療腦性癱瘓等小兒腦損傷提供了一定的實驗依據(jù)。

[1] 寧曉霞,師社會,胡海濤,等.腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體T rkB在大鼠新皮質的表達研究[J].陜西醫(yī)學雜志,2007,36(9):1122-1124.

[2] Wang TT,Yuan Y,Kang Y,et al.Effects of acupunctu re on the exp ression of glial cell line-derived neurotrophic factor(GDNF)and basic fibroblast grow th factor(FGF-2PbFGF)in the left six th lum bar dorsal root ganglion following removalof ad jacent dorsal root ganglial[J].Neu rosci Lett,2005,382(3):236-241.

[3] 李忠仁.實驗針灸學[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,2003:22-27.

[4] 王琴玉,王文花,靳瑞.針刺對窒息腦癱幼鼠腦組織膠質纖維酸性蛋白表達的影響[J].中國康復醫(yī)學雜志,2005,20(6):423-425.

[5] 王琴玉,孫硯輝,靳瑞.不同時窗針刺對窒息腦癱幼鼠腦組織b FGF表達的影響[J].中國康復,2005,20(4):195-197.

[6] 寧曉霞,師社會,邢亮,等.BDNF、TrkB在大鼠海馬CA 3區(qū)的表達及其與學習記憶的關系[J].陜西醫(yī)學雜志,2008,37(9):1130-1132.

[7] 彭洪軍,曹云濤,劉華慶.新生鼠腦缺血預處理后海馬CA 1區(qū)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達和意義[J].貴州醫(yī)藥,2006,30(4):311-314.

[8] 孫忠人,閆立平,謝兵,等.電針曲池、合谷穴腦功能性磁共振成像分析[J].中國中醫(yī)藥科技,2005,12(3):183.

[9] 牛小梅.中醫(yī)對新生兒缺氧缺血性腦病的認識及治療研究展望[J].現(xiàn)代中醫(yī)藥,2004,11(3):57-58.