彭艷紅，張梁，丁重陽(yáng)，王正祥，石貴陽(yáng)

1 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122

2 江南大學(xué)生物工程學(xué)院 生物資源與生物能源研究中心，無(wú)錫 214122

麻黃堿 (Ephedrine)，化學(xué)名為1-苯基-2-甲胺基丙醇，是一種從天然植物麻黃草中分離而得到的芳香族氨基醇衍生物，其立體異構(gòu)體 l-麻黃堿和 d-偽麻黃堿，分別主要用作支氣管擴(kuò)張劑和解充血?jiǎng)?，具有較強(qiáng)的藥理作用，廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)療中[1-3]。工業(yè)生產(chǎn)中，麻黃堿主要來(lái)源于麻黃植物直接提取和化學(xué)合成，但這兩種方法分別由于存在原料來(lái)源有限、生產(chǎn)成本高和異構(gòu)體分離困難、環(huán)境污染等問(wèn)題而限制了其發(fā)展[4]。利用生物轉(zhuǎn)化法制備光學(xué)純的手性化合物具有反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物單一，立體選擇性、區(qū)域選擇性和化學(xué)選擇性較高，并能完成一些化學(xué)合成難以進(jìn)行的反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，是大規(guī)模生產(chǎn)手性化合物的理想途徑之一，具有巨大發(fā)展?jié)摿5]。

本研究室前期成功篩選得到一株能夠利用 1-苯基-2-甲氨基丙酮 (1-phenyl-1-keto-2-methylamino propanone，簡(jiǎn)稱MAK) 為底物專一性轉(zhuǎn)化生成d-偽麻黃堿的菌株摩氏摩根菌 Morganella morganii CMCC(B)49208[1]，從中分離純化出調(diào)控此生物轉(zhuǎn)化過(guò)程的羰基還原酶 (MLDH)，并利用基因工程手段使其在大腸桿菌Escherichia coli中進(jìn)行了高效的表達(dá)。但是由于羰基還原酶在催化生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)需要一定量的輔酶作為電子傳遞體，該酶在轉(zhuǎn)化MAK為d-偽麻黃堿的過(guò)程中需要輔酶NADH來(lái)提供還原力[6-7]，如若通過(guò)外加輔酶提供則成本會(huì)大大增加，這極大地制約了其在工業(yè)上的應(yīng)用。而通過(guò)大腸桿菌在同一質(zhì)粒上共表達(dá)羰基還原酶基因mldh和葡萄糖脫氫酶基因gdh，由于本身MLDH酶活力不高且再生的輔酶不足等原因，導(dǎo)致最終產(chǎn)物產(chǎn)量并不高[8]。

枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis是目前研究較為詳盡的外源基因表達(dá)宿主，其葡萄糖脫氫酶 (Glucose dehydrogenase，GDH) 可以氧化葡萄糖生成葡萄糖酸同時(shí)生成還原型的輔酶NADH (NADPH)[9-10]。利用酶耦聯(lián)法可以解決生物轉(zhuǎn)化制備麻黃堿的過(guò)程中輔酶的再生問(wèn)題。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)利用 B. subtilis生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)d-偽麻黃堿的研究很少，未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)構(gòu)建枯草芽胞桿菌游離表達(dá)質(zhì)粒pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD 轉(zhuǎn)化入 B. subtilis Wb600 (蛋白酶缺陷型菌株) 中使得羰基還原酶能夠在枯草芽胞桿菌中表達(dá)并通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的GDH完成輔酶的再生，而避免外源性的加入，同時(shí)對(duì)重組菌專一性轉(zhuǎn)化產(chǎn)d-偽麻黃堿進(jìn)行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌E. coli JM109、B. subtilis Wb600、大腸-枯草桿菌穿梭載體 pHY300plk由江南大學(xué)工業(yè)微生物資源和信息中心 (CICIM-CU) 提供；pET28a-mldh 由本研究室構(gòu)建并保存；質(zhì)粒pHY300plk-PrpsD-TrpsD、pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD及菌株B. subtilis Wb600 (pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD) 為本研究中構(gòu)建。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，pH 7.0~7.2；制備固體培養(yǎng)基時(shí)另加入1.5%瓊脂粉；121 ℃滅菌20 min。用于大腸桿菌和枯草芽胞桿菌的培養(yǎng)，必要時(shí)，使用前加入氨芐青霉素 (Amp) 至終濃度100 mg/L用于重組大腸桿菌的篩選，加入四環(huán)素 (Tet) 至終濃度15 mg/L用于重組枯草芽胞桿菌的篩選。

1.1.3 工具酶和試劑

溶菌酶、核糖核酸酶、蛋白酶K、Taq DNA聚合酶、pfu DNA聚合酶、dNTPs、T4 DNA連接酶、NADH、限制性內(nèi)切酶 (XbaⅠ、KpnⅠ、BamHⅠ等)、堿性磷酸酶 (CIAP) 均購(gòu)于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒 DNA小量制備試劑盒、DNA Marker λ PstⅠ購(gòu)于博大泰克；膠回收試劑盒購(gòu)于碧云天生物公司；四環(huán)素鹽酸鹽 (Tetracycline HCl) 購(gòu)于北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；l-麻黃堿 (E) 和 d-偽麻黃堿 (PE) 化學(xué)對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品鑒定所；1-苯基-2-甲氨基丙酮 (MAK) 為本研究室合成；其他試劑藥品皆為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口的分析純和生化試劑。

1.2 方法

1.2.1 B. subtilis Wb600染色體DNA的提取

提取方法見(jiàn)文獻(xiàn)[11-12]，略有修改。

1.2.2 常規(guī)分子生物學(xué)基因操作

DNA片段膠回收、PCR產(chǎn)物純化用相應(yīng)的試劑盒進(jìn)行。質(zhì)粒DNA提取、DNA的酶切、連接、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化等常規(guī)分子操作參見(jiàn)文獻(xiàn)[11-12]。

1.2.3 基因的PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank上的枯草芽胞桿菌168菌株 (登錄號(hào)：NC_000964.3) rpsD基因的啟動(dòng)子和終止子的基因序列，設(shè)計(jì)引物 PrpsD_F和 PrpsD_R，TrpsD_F和 TrpsD_R，引物序列見(jiàn)表1，由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 文中所用引物及其序列Table 1 Primers and oligonucleotides used in this study

PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，冷卻至4 ℃，結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4 載體pHY300plk-PrpsD-TrpsD的構(gòu)建

BamHⅠ酶切質(zhì)粒 pHY300plk，純化后在 pfu DNA聚合酶作用下72 ℃延伸10 min，補(bǔ)平其上的BamHⅠ位點(diǎn)，得到載體pHY300plk-BamHⅠ(-)。SalⅠ、BamHⅠ酶切PrpsD片段，BamHⅠ、BglⅡ酶切 TrpsD 片段后與經(jīng) SalⅠ、BglⅡ酶切的pHY300plk-BamHⅠ(-) 質(zhì)粒連接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E. coli JM109，利用氨芐青霉素抗性篩選出重組子酶切驗(yàn)證。

1.2.5 游離表達(dá)載體pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD的構(gòu)建

BamHⅠ酶切質(zhì)粒pET28a-mldh后回收mldh片段，與經(jīng) BamHⅠ酶切的 pHY300plk-PrpsD-TrpsD連接轉(zhuǎn)化E. coli JM109，利用Amp抗性篩選出重組子酶切驗(yàn)證。同時(shí)，以陽(yáng)性質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增后檢測(cè)。另測(cè)定PrpsD-mldh-TrpsD基因序列，以確保PCR擴(kuò)增序列的準(zhǔn)確性，序列測(cè)定由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

1.2.6 重組菌B. subtilis Wb600(pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD) 的構(gòu)建

提取質(zhì)粒 pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD，參考文獻(xiàn)[13]所述方法制備枯草桿菌化學(xué)感受態(tài)并轉(zhuǎn)化B. subtilis Wb600，利用Tet (15 mg/L) 抗性篩選重組子，提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，以之前構(gòu)建好的質(zhì)粒pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD為對(duì)照，分別酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.7 細(xì)胞裂解液的制備

挑取陽(yáng)性重組枯草芽胞桿菌轉(zhuǎn)化子單菌落，接入含有Tet (15 mg/L) 的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h。次日，按接入培養(yǎng)基體積3%的接種量轉(zhuǎn)接至含有Tet (15 mg/L) 的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h。離心收集菌體，用磷酸緩沖液 (0.2 mol/L KH2PO4-Na2HPO4緩沖液(pH 7.5)，以下出現(xiàn)磷酸緩沖液如未加說(shuō)明均指該磷酸鈉鉀緩沖液) 洗滌 1~2次，離心后再用適量的預(yù)冷的磷酸緩沖液重懸菌體。超聲波破碎10 min (工作1 s停4 s)，保持菌液始終處于低溫 (0 ℃~4 ℃)。破壁后高速離心，上清液即為細(xì)胞裂解物，用于SDS-PAGE和生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)檢測(cè)。

1.2.8 重組菌B. subtilis Wb600(pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD) 的鑒定

挑取經(jīng) 1.2.6所示方法酶切驗(yàn)證的陽(yáng)性重組枯草芽胞桿菌轉(zhuǎn)化子接種于LB液體培養(yǎng)基，按1.2.7的方法制備細(xì)胞裂解液，SDS-PAGE檢測(cè)，電泳的方法和操作見(jiàn)文獻(xiàn)[14]。同時(shí)，取重組菌菌體破碎液進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)。反應(yīng)體系為：50 μg MAK，50 μmol葡萄糖，1 μmol NADH和適量酶液共1 mL，30 ℃轉(zhuǎn)化24 h。10 000 r/min離心10 min后，取上清液用于高效液相色譜法 (HPLC) 和超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法 (UPLC-MS) 檢測(cè)。

高效液相色譜法 (HPLC)[6]檢測(cè)條件：Hanbon Lichrospher C18柱；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；流速1 mL/min；柱溫40 ℃。流動(dòng)相為：甲醇∶0.02 mol/L KH2PO4∶乙酸∶三乙胺=4 ∶ 96 ∶ 0.2 ∶ 0.13 (V:V:V:V)。超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法 (UPLC- MS) 檢測(cè)條件：(A)色譜條件 色譜儀：Waters ACQUITY UPLC；檢測(cè)器：Waters ACQUITY PDA；分析柱：ACQUITY UPLC BEH HILIC (2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相A：乙腈；流動(dòng)相B：20 mmol/L醋酸銨水溶液；檢測(cè)波長(zhǎng)：200~600 nm；柱溫：30 ℃；流速：0.30 mL/min；總分析時(shí)間：15 min；進(jìn)樣體積：1.0 μL。(B) 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜系統(tǒng)：Waters SYNAPT MS檢測(cè)儀；軟件：Waters Masslynx V4.1質(zhì)譜工作站；離子源：ESI電離源；電離模式：ESI+；毛細(xì)管電壓：3.5 kV；錐孔電壓：20 V；離子源溫度：100 ℃；脫溶劑氣溫度：250 ℃；脫溶劑氣流量：500 L/h；錐孔氣流量：50 L/h；碰撞能量：6 eV；探測(cè)器電壓：1 600 V；掃描m/z范圍：50~500 Da；選擇離子：m/z 164、m/z 166。

1.2.9 重組菌B. subtilis Wb600 (pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD) 全細(xì)胞不對(duì)稱還原反應(yīng)

取適量培養(yǎng)一定時(shí)間的重組菌濕菌體加入適量MAK及葡萄糖，用pH 7.5的磷酸緩沖液補(bǔ)足至1 mL，30 ℃轉(zhuǎn)化24 h。10 000 r/min離心10 min，取上清用于HPLC檢測(cè)。HPLC檢測(cè)條件同1.2.8。

表2 液相色譜流動(dòng)相梯度洗脫表Table 2 UPLC gradient table

2 結(jié)果與分析

2.1 載體pHY300plk-PrpsD-TrpsD的構(gòu)建

提取陽(yáng)性菌落的質(zhì)粒DNA，進(jìn)行SalⅠ、BglⅡ雙酶切，電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，酶切后出現(xiàn) 4.9 kb、820 bp兩條帶，4.9 kb正是載體 (pHY300plk) 的大小，而820 bp為目的連接片段 (PrpsD-TrpsD) 的大小，說(shuō)明該質(zhì)粒已同時(shí)插入PrpsD和TrpsD片段，為重組質(zhì)粒pHY300plk-PrpsD-TrpsD。

2.2 游離表達(dá)載體pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD的構(gòu)建

提取陽(yáng)性菌落的質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切，電泳結(jié)果如圖1A所示，BamHⅠ酶切后出現(xiàn)兩條帶，分別為5.7 kb和1.1 kb，5.7 kb是載體pHY300plk-PrpsDTrpsD的大小，而1.1 kb為目的片段 (mldh) 的大小，說(shuō)明片段 mldh已插入質(zhì)粒中；SalⅠ、BglⅡ雙酶切后出現(xiàn)兩條帶，分別為4.9 kb和1.9 kb，4.9 kb為載體 pHY300plk的大小，1.9 kb為片段 PrpsD-mldh-TrpsD的大小，也說(shuō)明在該陽(yáng)性菌落的質(zhì)粒中已插入mldh片段。同時(shí)，以陽(yáng)性菌落的質(zhì)粒DNA為模板，PrpsD_F和TrpsD_R為上下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1B所示，PCR產(chǎn)物為 1.9 kb，這進(jìn)一步證明質(zhì)粒 pHY300plk-PrpsDTrpsD中已插入mldh片段。

由于采用單酶切進(jìn)行連接，需進(jìn)行正反接驗(yàn)證，查閱基因序列，片段上酶切位點(diǎn)均有限制，因此通過(guò)測(cè)定 PrpsD-mldh-TrpsD基因序列間接驗(yàn)證 mldh片段連接的正確與否。提取質(zhì)粒pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD，測(cè)定該質(zhì)粒上PrpsD-mldh-TrpsD基因片段的核酸序列，序列測(cè)定結(jié)果顯示該 PrpsD和TrpsD序列與已報(bào)道的枯草芽胞桿菌168菌株rpsD基因的啟動(dòng)子和終止子的基因序列一致，同時(shí)mldh片段的連接為正向，說(shuō)明該質(zhì)粒已成功地正確連接上PrpsD、mldh和TrpsD片段。

圖1 重組質(zhì)粒pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)Fig. 1 Detection of recombinant plasmid pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD by agarose gel electrophoresis. (A) Restriction enzyme analysis of plasmid pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD. (B) PCR analysis of plasmid pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD. (C) Restriction enzyme analysis of plasmid pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD from recombinant B. subtilis Wb600. M: λ/Pst I DNA marker; 1: pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD/Sal I/Bgl II; 2: pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD/BamH I; 3: PCR amplification of PrpsD-mldh-TrpsD from plasmid pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD; 4: pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD/Sal I; 5: plasmid from recombinant B. subtilis/Sal I.

2.3 重組菌B. subtilis Wb600(pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD) 的鑒定

2.3.1 質(zhì)粒的檢測(cè)

提取陽(yáng)性菌落的質(zhì)粒DNA，SalⅠ酶切后電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1C所示，枯草芽胞桿菌重組子中含有與原轉(zhuǎn)化所用質(zhì)粒大小一致的質(zhì)粒，初步認(rèn)為該陽(yáng)性重組子中已轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒 pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD。

2.3.2 SDS-PAGE檢測(cè)

取重組菌菌體破碎液進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖2所示，重組菌B. subtilis Wb600 (pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD) 細(xì)胞中有相對(duì)分子質(zhì)量約為42.5 kDa的蛋白得以表達(dá)。根據(jù)本研究室前期文獻(xiàn)

[7]報(bào)道羰基還原酶的相對(duì)分子質(zhì)量為42.5 kDa，這說(shuō)明重組枯草芽胞桿菌能表達(dá)羰基還原酶。

圖2 枯草芽胞桿菌Wb600及其重組菌SDS-PAGE檢測(cè)Fig. 2 Detection of B. subtilis Wb600 and its recombinant strain by SDS-PAGE. 1: cell crude extract of B. subtilis Wb600; 2: cell crude extract of B. subtilis Wb600 (pHY300plk); 3: cell crude extract of B. subtilis Wb600 (pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD); M: standard protein molecular weight marker.

2.3.3 生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)及檢測(cè)

取重組菌菌體破碎液進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后取上清液進(jìn)行HPLC和UPLC-MS檢測(cè)產(chǎn)物。HPLC檢測(cè)結(jié)果如圖 3所示，從圖中可以看出，在重組菌轉(zhuǎn)化液色譜圖中有保留時(shí)間分別為29.23 min和31.43 min的峰，對(duì)照標(biāo)樣圖譜，這兩個(gè)峰分別對(duì)應(yīng)MAK和d-偽麻黃堿，初步判斷重組菌的生物轉(zhuǎn)化液中含有d-偽麻黃堿。而33.8 min的峰在添加與不添加MAK的轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中都會(huì)產(chǎn)生，該物質(zhì)并非轉(zhuǎn)化反應(yīng)的副產(chǎn)物，而可能是細(xì)胞本身產(chǎn)生的某種物質(zhì)。對(duì)其進(jìn)行 UPLC-MS分析，初步得出其分子量為227.2，但仍未能確定是何種物質(zhì)，有待進(jìn)一步的研究。

為進(jìn)一步確定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(UPLC-MS)對(duì)轉(zhuǎn)化液進(jìn)行分析，測(cè)定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分子量，結(jié)果如圖4所示。其中圖A、B、C分別為MAK、l-麻黃堿和d-偽麻黃堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的選擇離子色譜-質(zhì)譜圖。從MAK、l-麻黃堿和d-偽麻黃堿的選擇離子色譜-質(zhì)譜圖中，可以得到各自的母離子[M+H]+分別為164、166和166；同時(shí)在選擇各自的特征離子 (146、148和148) 下，色譜圖相應(yīng)位置處分別有最大響應(yīng)值，保留時(shí)間分別為3.56 min、7.85 min、7.98 min。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜保留時(shí)間和質(zhì)譜圖可以用來(lái)確定轉(zhuǎn)化液中的物質(zhì)。圖 D為重組菌轉(zhuǎn)化液的選擇離子色譜-質(zhì)譜圖。從圖中可以看出，在同時(shí)選擇特征離子146和148下，重組菌轉(zhuǎn)化液中在保留時(shí)間分別為3.52 min和7.96 min處有最大響應(yīng)值，對(duì)照標(biāo)樣圖譜，這兩個(gè)峰分別對(duì)應(yīng)MAK和d-偽麻黃堿的峰，同時(shí)根據(jù)這兩個(gè)峰的質(zhì)譜圖可知其對(duì)應(yīng)的分子量分別為 163(164-1) 和165(166-1)，即為MAK和麻黃堿的分子量大小，因而可以判斷重組菌的轉(zhuǎn)化液中含有d-偽麻黃堿。

圖3 標(biāo)樣和重組菌轉(zhuǎn)化液的HPLC圖譜Fig. 3 HPLC chromatogram of the transformation products and the standard sample. (A) HPLC chromatogram of the standard sample (l-ephedrine, MAK and d-pseudoephedrine). (B) HPLC chromatogram of the transformation products in the presence of MAK from recombinant B. subtilis. (C) HPLC chromatogram of the transformation products in the absence of MAK from recombinant B. subtilis.

圖4 標(biāo)樣和重組菌轉(zhuǎn)化液的選擇離子色譜-質(zhì)譜圖Fig. 4 Selected ion chromatogram and mass spectrometry of the transformation products from recombinant B. subtilis and the standard sample. (A) Selected ion chromatogram (m/z146) and mass spectrometry of MAK. (B) Selected ion chromatogram (m/z148) and mass spectrometry of l-ephedrine. (C) Selected ion chromatogram (m/z148) and mass spectrometry of d-pseudoephedrine. (D) Selected ion chromatogram (m/z146+148) and mass spectrometry of the transformation products from recombinant B. subtilis.

2.4 重組菌B. subtilis Wb600(pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD) 全細(xì)胞不對(duì)稱還原反應(yīng)

2.4.1 菌體用量對(duì)重組菌全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的影響

分別取培養(yǎng)時(shí)間為12 h的不同量重組菌濕菌體，加入9 mg 葡萄糖和0.05 mg的MAK轉(zhuǎn)化反應(yīng)，HPLC分析測(cè)定，結(jié)果如圖5所示。增加菌體用量，產(chǎn)物的產(chǎn)量會(huì)有不同程度的增長(zhǎng)，其中以菌體量從0.1 g增加到0.2 g時(shí)增長(zhǎng)幅度最大，而當(dāng)菌體量大于0.2 g時(shí)，產(chǎn)物產(chǎn)量趨于穩(wěn)定，這與本研究室前期研究結(jié)果相一致[6]，故選擇0.2 g作為后續(xù)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的菌體加入量。

圖5 菌體用量對(duì)全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的影響Fig. 5 Effect of the amount of cell on whole-cell biotransformation.

2.4.2 葡萄糖濃度對(duì)重組菌全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的影響

取0.2 g培養(yǎng)時(shí)間為12 h的重組菌濕菌體，加入 0.05 mg MAK和不同量的葡萄糖轉(zhuǎn)化反應(yīng)，HPLC分析測(cè)定，結(jié)果如圖6所示。在糖濃度為18 g/L時(shí)產(chǎn)物的產(chǎn)量最高。當(dāng)糖濃度低于 18 g/L時(shí)，產(chǎn)物的量隨糖濃度的升高而增加；而當(dāng)糖濃度超過(guò)18 g/L后，由于高濃度的葡萄糖抑制GDH的酶活，輔酶NADH生成較少，最終導(dǎo)致隨著糖濃度的繼續(xù)增高產(chǎn)物產(chǎn)量反而降低。

2.4.3 底物MAK濃度對(duì)重組菌全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的影響

取0.2 g培養(yǎng)時(shí)間為12 h的重組菌濕菌體，加入 18 mg的葡萄糖和不同量的 MAK轉(zhuǎn)化反應(yīng)，HPLC分析測(cè)定，結(jié)果如圖7所示。底物MAK在加入濃度為 0.4 g/L時(shí)產(chǎn)物的產(chǎn)量最高。當(dāng) MAK濃度低于0.4 g/L時(shí)，隨著底物濃度的增加隨之增加；而當(dāng)MAK濃度高于0.4 g/L時(shí)，由于在高濃度MAK下存在底物抑制作用，酶活降低，產(chǎn)物產(chǎn)量隨著底物濃度的增加反而降低。

圖6 葡萄糖濃度對(duì)全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的影響Fig. 6 Effect of the concentration of glucose on whole-cell biotransformation.

圖7 底物MAK濃度對(duì)全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的影響Fig. 7 Effect of the concentration of MAK on whole-cell biotransformation.

2.4.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)重組菌全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的影響

取 0.2 g不同培養(yǎng)時(shí)間的重組菌濕菌體，加入18 mg的葡萄糖和0.4 mg的MAK轉(zhuǎn)化反應(yīng)，HPLC分析測(cè)定，結(jié)果如圖 8所示。不同培養(yǎng)時(shí)間下，培養(yǎng)12 h其轉(zhuǎn)化生成d-偽麻黃堿的產(chǎn)量最高。不同時(shí)間收集的菌體，細(xì)胞所處的生長(zhǎng)周期不同，因而外源基因的表達(dá)量不同，進(jìn)而影響到產(chǎn)物的產(chǎn)量。培養(yǎng)時(shí)間不夠外源基因得不到充分表達(dá)，產(chǎn)物產(chǎn)量低；過(guò)長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞衰亡并產(chǎn)生大量毒素和次生產(chǎn)物導(dǎo)致酶活力下降而限制產(chǎn)量。

圖8 細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間對(duì)全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的影響Fig. 8 Effect of culture time on whole-cell biotransformation.

2.4.5 較優(yōu)條件下重組菌全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化

取0.2 g培養(yǎng)時(shí)間為12 h的重組菌濕菌體，加入18 mg的葡萄糖和0.4 mg的MAK轉(zhuǎn)化反應(yīng)，HPLC分析測(cè)定d-偽麻黃堿的產(chǎn)量為97.5 mg/L，底物摩爾轉(zhuǎn)化率為24.1%。

3 討論

近些年，麻黃堿和偽麻黃堿不僅用于多種藥物制劑，在國(guó)外還用于營(yíng)養(yǎng)食品補(bǔ)充劑、減肥劑等，應(yīng)用領(lǐng)域廣泛，市場(chǎng)活躍。利用生物轉(zhuǎn)化同時(shí)酶耦聯(lián)再生輔酶的方法制備麻黃堿是大規(guī)模生產(chǎn)麻黃堿的理想途徑之一，具有巨大發(fā)展?jié)摿??？莶菅堪麠U菌作為目前原核表達(dá)系統(tǒng)中較理想的宿主，生理、生化、遺傳及分子生物學(xué)研究背景良好，與大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)相比具有以下特點(diǎn)：非致病性；密碼子偏好型不明顯，轉(zhuǎn)錄翻譯機(jī)制清楚[15]；雖表達(dá)水平低，但避免了蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊或不完全合成和易形成包涵體的缺點(diǎn)[16]。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)和基因工程的發(fā)展，枯草芽胞桿菌作為基因工程表達(dá)系統(tǒng)發(fā)展迅速，并展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。

本文首次報(bào)道了利用 B. subtilis生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)d-偽麻黃堿，重組B. subtilis在葡萄糖存在的情況下能夠催化底物MAK轉(zhuǎn)化生成d-偽麻黃堿。研究選擇B. subtilis Wb600作為宿主，利用強(qiáng)啟動(dòng)子PrpsD和終止子TrpsD實(shí)現(xiàn)mldh在枯草芽胞桿菌中的高效表達(dá)，同時(shí)通過(guò)細(xì)胞內(nèi)GDH解決輔酶的再生問(wèn)題。對(duì)重組菌進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)物產(chǎn)量最高為97.5 mg/L，底物摩爾轉(zhuǎn)化率為24.1%，成功實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)酶的生物轉(zhuǎn)化功能，避免了昂貴的輔酶外源性的加入，大大降低了產(chǎn)物的制備成本。

本研究室前期研究中，利用 M. morganii催化MAK生產(chǎn)d-偽麻黃堿，通過(guò)外加輔酶，由于輔酶提供充足，最終產(chǎn)物產(chǎn)量為85.2 mg/L，摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)84.4%[6]；而利用共表達(dá)mldh和gdh的重組大腸桿菌不對(duì)稱還原產(chǎn) d-偽麻黃堿，雖然實(shí)現(xiàn)了輔酶在細(xì)胞內(nèi)的再生，但由于本身MLDH酶活力不高且再生的輔酶未能完全替代外加輔酶的作用，結(jié)果最終產(chǎn)物產(chǎn)量和摩爾轉(zhuǎn)化率均不是很高，分別為 58 mg/L和 57.6%[8]；相比之下，本研究中產(chǎn)物產(chǎn)量稍有提高，但底物摩爾轉(zhuǎn)化率較低。從文中葡萄糖濃度對(duì)轉(zhuǎn)化的影響可知，在一定濃度范圍內(nèi)產(chǎn)物的量隨糖濃度的升高而增加，但增長(zhǎng)幅度并不大，初步判斷可能是由于轉(zhuǎn)化反應(yīng)過(guò)程中GDH酶活力不高，雖增加葡萄糖濃度，但輔酶仍提供不足，導(dǎo)致最終產(chǎn)物產(chǎn)量相差不大。此外，相比外加輔酶，通過(guò)葡萄糖脫氫酶實(shí)現(xiàn)輔酶的再生，其在氧化葡萄糖生成輔酶的同時(shí)也存在葡萄糖酸的產(chǎn)生，而葡萄糖酸的產(chǎn)生會(huì)影響反應(yīng)體系的 pH，導(dǎo)致反應(yīng)未能在較適的 pH條件下進(jìn)行，最終影響產(chǎn)物的產(chǎn)量。本研究雖然實(shí)現(xiàn)了mldh基因在枯草芽胞桿菌中的高效表達(dá)，在不外加輔酶的情況下可以轉(zhuǎn)化生產(chǎn)麻黃堿，但仍未能較好地解決轉(zhuǎn)化過(guò)程中輔酶的需求問(wèn)題，后續(xù)可以進(jìn)一步考察增加GDH拷貝數(shù)或更改MLDH與GDH兩者之間的比例關(guān)系從而提高產(chǎn)物的產(chǎn)量；或通過(guò)篩選自身GDH酶活力較高的野生型菌株，以其為宿主表達(dá)羰基還原酶基因?qū)崿F(xiàn)產(chǎn)物的高產(chǎn)。這些研究對(duì)于工業(yè)應(yīng)用重組枯草芽胞桿菌生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn) d-偽麻黃堿具有重要意義。

REFERENCES

[1] Zhang L, Ding ZY, Shi GY. Asymmetric biosynthesis of (1S,2S)-ephedrine by Morganella morganii CMCC(B) 49208. Afr J Biotechnol, 2009, 8(4): 694?698.

[2] Krizevski R, Bar E, Shalit O, et al. Composition and stereochemistry of ephedrine alkaloids accumulation in Ephedra sinica Stapf. Phytochemistry, 2010, 71(8/9): 895?903.

[3] Rothman RB, Vu N, Partilla JS, et al. In vitro characterization of ephedrine related stereoisomers at biogenic amine transporters and the receptorome reveals selective actions as norepinephrine transporter substrates. J Pharmacol Exp Ther, 2003, 307(1): 138?145.

[4] Chen P, Wang JH. Discussion about reformation of ephedrine production technology. Environ Protect Xinjiang, 2002, 24(3): 25?27.陳平, 王江紅. 麻黃堿生產(chǎn)工藝改進(jìn)分析. 新疆環(huán)境保護(hù), 2002, 24(3): 25?27.

[5] Yoshihiko Y. Application of biotransformation in the chiral industry: oxido-reductases reaction. Biosci Ind, 2005, 63(5): 308?311.

[6] Dong SJ, Shi GY, Lu Y, et al. Microbial transformation for d-pseudo-ephedrine by Morganella morganii. J Wuxi Univ Light Ind, 2004, 23(2): 5?7.董世建, 石貴陽(yáng), 盧燕, 等. 微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn) d-偽麻黃堿. 無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 23(2): 5?7.

[7] Zhang PH, Zhang L, Lu Y, et al. Purification and characterization of carbonyl enantioselective reductase from Morganella morganii J-8. Chin J Biotech, 2007, 23(2): 268?272.張鵬華, 張梁, 盧燕, 等. Morganella morganii J-8羰基不對(duì)稱還原酶的分離純化及性質(zhì)研究. 生物工程學(xué)報(bào), 2007, 23(2): 268?272.

[8] Yuwen WG. Study on asymmetric carbonyl reduction of prochiral aromatic ketone to d-pseudoephedrine by co-expression recombinant Escherichia coli [D]. Wuxi: Jiangnan University, 2009.宇文偉剛. 共表達(dá)型重組大腸桿菌不對(duì)稱還原產(chǎn)d-偽麻黃堿的研究[D]. 無(wú)錫: 江南大學(xué), 2009.

[9] Yun H, Choi HL, Fadnavis NW, et al. Stereospecific synthesis of (R)-2-hydroxy carboxylic acids using recombinant E. coli BL21 overexpressing YiaE from Escherichia coli K12 and glucose dehydrogenase from Bacillus subtilis. Biotechnol Progr, 2005, 21(2): 366?371.

[10] Xu ZN, Jing KJ, Liu Y, et al. High level expression of recombinant glucose dehydrogenase and its application in NADPH regeneration. J Ind Microbiol Biotechnol, 2007, 34(1): 83?90.

[11] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989: 20?25.

[12] Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, et al. Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons Inc, 2002: 56?80.

[13] Heng C, Chen ZJ, Du LX, et al. Expression and secretion of an acid-stable α-amylase gene in Bacillus subtilis by SacB promoter and signal peptide. Biotechnol Lett, 2005, 27(21): 1731?1737.

[14] Wang JZ, Fan M. Protein Technical Manual. Beijing: Science Press, 2001: 77?101.汪家政, 范明. 蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè). 北京: 科學(xué)出版社, 2001: 77?101.

[15] Le ATT, Schumann W. A novel cold-inducible expression system for Bacillus subtilis. Protein Expr Purif, 2007, 53(2): 264?269.

[16] Zweers JC, Barák I, Becher D, et al. Towards the development of Bacillus subtilis as a cell factory for membrane proteins and protein complexes. Microb Cell Fact, 2008, 7: 10?29.