郭勇，劉璐，郝慶新，李瑞欣，張西正，王亮，寧波

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生裝備研究所，天津 300161

細(xì)胞外基質(zhì) (Extra cellular matrix，ECM) 是機(jī)體發(fā)育過(guò)程中由細(xì)胞分泌到細(xì)胞外空間的分泌蛋白和多糖構(gòu)成的精密有序的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[1-2]。ECM對(duì)組織細(xì)胞起支持、保護(hù)、營(yíng)養(yǎng)作用，在細(xì)胞的增殖、分化、代謝、識(shí)別、黏著、遷移等基本生命活動(dòng)方面起重要作用[3-4]。

ECM 在細(xì)胞的功能和生長(zhǎng)分化方面起重要調(diào)節(jié)作用[5-6]，為維護(hù)體外和體內(nèi)的細(xì)胞生長(zhǎng)提供重要微環(huán)境[7]。從仿生角度看細(xì)胞外基質(zhì)更接近天然狀態(tài)，是優(yōu)良的生物材料和組織工程支架[8]，必將在細(xì)胞和組織工程等方面得到更廣泛和深入的應(yīng)用。膠原、層粘連蛋白、纖連蛋白等ECM成分早已作為培養(yǎng)皿 (瓶) 表面裱襯材料得到應(yīng)用，可促進(jìn)細(xì)胞的粘附和生長(zhǎng)[9-10]。近年來(lái)，ECM 對(duì)細(xì)胞 (組織) 生長(zhǎng)分化的研究更加深入全面，很多研究通過(guò)脫細(xì)胞技術(shù)，脫去體外培養(yǎng)的細(xì)胞，獲得包被在培養(yǎng)皿或支架上的ECM，然后研究這些ECM的生物活性。例如：體外形成的成骨細(xì)胞ECM在二維條件下和三維條件下均可促進(jìn)干細(xì)胞骨向分化[11-12]。軟骨細(xì)胞來(lái)源的ECM可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨向分化，維持軟骨細(xì)胞的特征，并有助于軟骨組織形成[13]。體外形成的心肌成纖維細(xì)胞 ECM可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的粘附和增殖。研究者將體內(nèi)不同組織的ECM包被在培養(yǎng)皿 (板) 上，發(fā)現(xiàn)這些ECM在體外培養(yǎng)條件下可促進(jìn)同種組織細(xì)胞的生長(zhǎng)并有助于保持同種組織來(lái)源細(xì)胞的分化狀態(tài)[14]。

分析以上研究結(jié)果，我們認(rèn)為體外培養(yǎng)細(xì)胞形成的ECM也具有“組織特異性”，即不同組織來(lái)源的ECM具有不同生物活性。為證實(shí)這個(gè)假設(shè)，我們選擇了兩種比較典型的細(xì)胞：原代小鼠成骨細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞。利用脫細(xì)胞技術(shù)，獲得這兩種ECM包被的培養(yǎng)皿 (板)，將小鼠成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1接種在包被了體外形成的成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞外基質(zhì)的培養(yǎng) (皿) 板中，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、骨向分化，比較這兩種ECM的生物活性，探討二維培養(yǎng)條件下不同ECM對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的影響，為將ECM用于不同的細(xì)胞和組織工程打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

C57小鼠乳鼠 (軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心)，MC3T3-E1細(xì)胞 (中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))，α-MEM培養(yǎng)液、胎牛血清 (Invitrogen公司)，MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)盒 (Promega公司)，鈣檢測(cè)試劑盒 (南京建成生物工程所)，堿性磷酸酶活性檢測(cè)試劑盒和AEC顯色液 (北京中杉公司)，兔抗骨形成蛋白2抗體、兔抗骨橋蛋白抗體 (武漢博士德公司)，VG膠原染色試劑盒 (福建邁威公司)，化學(xué)發(fā)光液 (Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 ECM包被培養(yǎng)板的制備

無(wú)菌條件下取 C57小鼠乳鼠顱頂骨和心室組織，分別剪成碎片，以組織塊法培養(yǎng)成骨細(xì)胞[15]和心肌成纖維細(xì)胞，傳到第3代后，將成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分別接種于培養(yǎng)板中培養(yǎng)6 d。通過(guò)去細(xì)胞處理-PBS緩沖液反復(fù)清洗后獲得ECM包被培養(yǎng)板[16]，按照試劑盒說(shuō)明書，進(jìn)行Van Gieson (VG) 膠原纖維染色觀察并拍照，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ECM骨形成蛋白2免疫組化

將包被于培養(yǎng)板中的ECM用95%乙醇固定，蒸餾水漂洗3次，5% BSA室溫封閉20 min后，滴加1∶200倍稀釋的兔抗骨形成蛋白2多克隆抗體，4 ℃過(guò)夜，PBS磷酸鹽緩沖液漂洗2 min，重復(fù)3次；滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG，37 ℃濕盒孵育45 min，PBS磷酸鹽緩沖液漂洗2 min，重復(fù)3次；AEC顯色液室溫顯色10 min，顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.3 細(xì)胞的接種和生長(zhǎng)

將MC3T3-E1細(xì)胞以每孔1.0×104個(gè)細(xì)胞的密度接種在24孔ECM包被培養(yǎng)板中，以含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液接種1、3、5、7 d后，以MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)盒檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性，增殖活性以560 nm下的吸光值 (A560) 表示相對(duì)大小。以未包被ECM的培養(yǎng)板為對(duì)照。

1.2.4 MC3T3-E1細(xì)胞的骨向誘導(dǎo)

將細(xì)胞以每孔 2.0×104個(gè)細(xì)胞的密度接種在24孔ECM包被培養(yǎng)板中，以含50 mg/L維生素C、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉的α-MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，每3天換1次培養(yǎng)液。誘導(dǎo)后，檢測(cè)細(xì)胞骨向分化：

1) 堿性磷酸酶活性檢測(cè)

以含0.1% Triton-X100的PBS室溫下處理培養(yǎng)板中的細(xì)胞30 min，反復(fù)凍融3次后，用堿性磷酸酶活性檢測(cè)盒試劑盒檢測(cè)裂解液中的堿性磷酸酶活性，按照說(shuō)明書進(jìn)行，酶活性以裂解液總活性金氏單位 (U) 與其總蛋白含量 (g) 的比值表示 (U/g)。

2) 骨形成蛋白2和骨橋蛋白免疫印跡檢測(cè)

將細(xì)胞以 0.25%的胰蛋白酶消化后離心，PBS重懸后再離心1次，RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒定量。常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，然后分別用兔抗骨橋蛋白和BMP-2抗體 (1∶500) 孵育，二抗采用 HRP耦聯(lián)的羊抗兔(1∶1 000)，以GAPDH為內(nèi)參，化學(xué)發(fā)光液作用10 min后X光片曝光顯影。掃描膠片后以圖像分析軟件QuantityOne分析蛋白含量變化。

3) 鈣分泌檢測(cè)

在24孔板培養(yǎng)7 d的細(xì)胞用PBS洗滌2次，每孔加入200 μL 0.1 mol/L的HCl，反復(fù)吹打裂解，室溫下處理24 h，然后收集所有裂解液，4 000 r/min離心，棄細(xì)胞碎片，通過(guò)鈣檢測(cè)試劑盒測(cè)定上清液中的鈣含量，此即為培養(yǎng)板的總鈣含量，同時(shí)檢測(cè)ECM包被的培養(yǎng)板中的鈣含量，總鈣含量減去ECM培養(yǎng)板的鈣含量，即為細(xì)胞實(shí)際分泌的鈣量。

以上實(shí)驗(yàn)均以未包被ECM的培養(yǎng)板為對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 ECM的觀察和染色

倒置纖維鏡下觀察ECM包被的培養(yǎng)板，未見(jiàn)任何細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可見(jiàn)到織網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)，VG染色可見(jiàn)紅色膠原纖維，也未見(jiàn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，兩種ECM的形態(tài)基本相同 (圖 1)。BMP-2免疫組化顯示成骨細(xì)胞ECM為陽(yáng)性，成纖維細(xì)胞ECM為陰性 (圖2)。

2.2 細(xì)胞增殖檢測(cè)

MC3T3-E1細(xì)胞在ECM培養(yǎng)板上培養(yǎng)2 d，就發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞ECM包被板中細(xì)胞的A560值最高，且顯著高于對(duì)照組和成骨細(xì)胞 ECM組，成骨細(xì)胞ECM組的A560值也顯著高于對(duì)照組；培養(yǎng)3 d后，檢測(cè)結(jié)果與培養(yǎng)2 d后的基本相同，接種于成纖維細(xì)胞ECM包被板中的細(xì)胞的A560值為最高；培養(yǎng)5 d后，成纖維細(xì)胞ECM包被板中細(xì)胞的A560值仍最高，且顯著高于對(duì)照組，但成骨細(xì)胞 ECM組的A560值與對(duì)照組無(wú)明顯差異；培養(yǎng) 7 d后 3組 A560值均無(wú)顯著差異 (圖3)。

圖1 ECM VG膠原纖維的染色Fig. 1 VG histochemical staining for collagen fiber of ECMs. (A) Osteoblasts ECM. (B) Fibroblasts ECM.

圖2 ECM BMP-2免疫組化染色Fig.2 Immunohistochemical staining for BMP-2 of ECMs. (A) Osteoblasts ECM. (B) Fibroblasts ECM.

2.3 細(xì)胞分化檢測(cè)

2.3.1 堿性磷酸酶活性檢測(cè)

MC3T3-E1細(xì)胞在ECM包被培養(yǎng)板中培養(yǎng)3 d后，3組中堿性磷酸酶活性雖有差異但不顯著；培養(yǎng)5 d后，3組中堿性磷酸酶活性開(kāi)始有了明顯差異，成骨細(xì)胞ECM組的酶活性顯著高于其他2組，其他2組間酶活性無(wú)明顯差異；培養(yǎng)7 d后，3組的酶活性差距明顯降低，但仍是成骨細(xì)胞ECM組的酶活性最高 (圖4)。

2.3.2 骨形成蛋白2和骨橋蛋白免疫印跡

MC3T3-E1細(xì)胞在ECM包被培養(yǎng)板中培養(yǎng)5 d后，其骨形成蛋白 2免疫印跡結(jié)果顯示：對(duì)照組和成纖維細(xì)胞ECM組BMP-2蛋白表達(dá)水平差別不大，成骨細(xì)胞 ECM組的 BMP-2蛋白表達(dá)水平最高，BMP-2蛋白表達(dá)水平顯著高于其他組 (圖5)。培養(yǎng)5 d后骨橋蛋白免疫印跡結(jié)果與BMP-2的結(jié)果相同：對(duì)照組和成纖維細(xì)胞 ECM組蛋白表達(dá)水平差別不大，成骨細(xì)胞ECM組的骨橋蛋白表達(dá)最高。

圖3 MC3T3-E細(xì)胞增殖活性 MTT檢測(cè) (*P<0.05; **P<0.01)Fig. 3 MC3T3-E1Cells proliferation assay with MTT. *P<0.05; **P<0.01.

圖 4 MC3T3-E1堿性磷酸酶活性檢測(cè)(*P<0.05; **P<0.01)

Fig. 4 Alkaline phosphatase activity of MC3T3-E1 assay. *P<0.05; **P<0.01.

圖5 MC3T3-E1BMP-2免疫印跡檢測(cè)Fig. 5 Western blotting analysis of BMP-2 in MC3T3-E1cella. (A) Photo of Western blotting. (B) Relative protein levels. **P<0.01.

圖6 MC3T3-E1骨橋蛋白免疫印跡檢測(cè)Fig. 6 Western blotting analysis of osteopontin in MC3T3-E1cells. (A) Photo of Western blotting. (B) Relative protein levels. **P<0.01.

圖7 MC3T3-E1細(xì)胞鈣分泌量檢測(cè) (**P<0.01)Fig. 7 Secreted calcium assay of MC3T3-E1 cells. **P<0.01.

2.3.3 鈣分泌檢測(cè)

MC3T3-E1細(xì)胞在ECM包被培養(yǎng)板中培養(yǎng)7 d后，其鈣分泌檢測(cè)結(jié)果顯示：對(duì)照組和成纖維細(xì)胞ECM組差別不大，成骨細(xì)胞ECM組的鈣分泌量最高，比其他組高1倍左右，如圖7所示。

3 討論

細(xì)胞外基質(zhì)是細(xì)胞重要生存環(huán)境，從上世紀(jì)60年代開(kāi)始，研究者就逐漸發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)在調(diào)節(jié)胚胎組織發(fā)育和細(xì)胞分化方面有重要作用[17]。細(xì)胞外基質(zhì)或細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原、粘連蛋白等已用于包被細(xì)胞培養(yǎng)板 (瓶)[18]或用于組織工程支架[19]，這些基質(zhì)成分可促進(jìn)細(xì)胞的粘附和生長(zhǎng)，甚至可促進(jìn)細(xì)胞的分化。因此，在細(xì)胞/組織工程研究中，要充分考慮細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)成分的作用。

組織工程支架材料，本質(zhì)上就是細(xì)胞外基質(zhì)材料，細(xì)胞外基質(zhì)是一種復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)狀的具有生物活性功能的復(fù)合材料。在組織修復(fù)方面已得到廣泛應(yīng)用的脫細(xì)胞小腸粘膜下層、脫細(xì)胞膀胱粘膜下層等脫細(xì)胞材料以及脫細(xì)胞/蛋白松質(zhì)骨[20-24]，都是細(xì)胞外基質(zhì)材料，人工的支架材料，也必須模擬細(xì)胞外基質(zhì)，才有可能得到更好的應(yīng)用[24]。Nicholas發(fā)現(xiàn)MC3T3-E1細(xì)胞ECM可促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[25]。Pham等以骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞ECM包被三維鈦支架，發(fā)現(xiàn)該支架可促進(jìn)骨髓干細(xì)胞的成骨分化[26]?？梢?jiàn)，細(xì)胞外基質(zhì)在促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化方面有重要作用，在組織工程支架材料的改進(jìn)方面，也有積極作用。

本實(shí)驗(yàn)制備出原代小鼠心肌成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞的ECM包被的兩種細(xì)胞培養(yǎng)板，通過(guò)觀測(cè)體外二維培養(yǎng)條件下 MC3T3-E1細(xì)胞的增殖和分化情況，首次比較這兩種ECM的生物活性，為將ECM用于組織工程打下基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)所制備的兩種ECM包被的培養(yǎng)板，均未見(jiàn)任何細(xì)胞結(jié)構(gòu)，通過(guò)顯微觀察，可見(jiàn)網(wǎng)絡(luò)狀顯微結(jié)構(gòu)，經(jīng)VG膠原染色表明是膠原纖維，膠原是ECM的主要成分之一，這表明本實(shí)驗(yàn)制備的ECM包被培養(yǎng)板是成功的。將MC3T3-E1細(xì)胞接種在成纖維細(xì)胞ECM包被的培養(yǎng)板中，培養(yǎng)1 d，即檢測(cè)出細(xì)胞的增殖活性明顯高于其他組，成骨細(xì)胞ECM組的增殖活性也高于對(duì)照組；培養(yǎng)3 d后，增殖活性與其他組間的差距更明顯，5 d后細(xì)胞達(dá)到飽和，各組間幾乎無(wú)差異，這表明ECM可促進(jìn)細(xì)胞的增殖，成纖維細(xì)胞ECM的效果可能要優(yōu)于成骨細(xì)胞ECM。另外，成骨細(xì)胞ECM中含BMP-2，這是一種重要的成骨誘導(dǎo)因子，可誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，導(dǎo)致骨形成[27-28]，存在于骨基質(zhì)中和在體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞胞外膠原纖維中[23]。這表明本實(shí)驗(yàn)制備的成骨細(xì)胞ECM可能具有成骨活性。

本實(shí)驗(yàn)將MC3T3-E1細(xì)胞接種在兩種ECM包被的培養(yǎng)板中，通過(guò)檢測(cè)堿性磷酸酶、BMP-2、骨橋蛋白以及鈣分泌量，來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞的骨向分化。在成骨細(xì)胞ECM培養(yǎng)板中的MC3T3-E1細(xì)胞在堿性磷酸酶、BMP-2和鈣分泌量方面的指標(biāo)均明顯高于對(duì)照組和成纖維細(xì)胞ECM組，堿性磷酸酶、骨橋蛋白、骨形成蛋白 2、骨橋蛋白以及鈣分泌量均是骨向分化的重要指標(biāo)，這表明成骨細(xì)胞ECM可促進(jìn)細(xì)胞的骨向分化。在成纖維細(xì)胞 ECM 培養(yǎng)板中的MC3T3-E1細(xì)胞在堿性磷酸酶、BMP-2、骨橋蛋白以及鈣分泌量方面的指標(biāo)與對(duì)照組的差別不明顯或較小，表明成纖維細(xì)胞ECM對(duì)細(xì)胞骨向分化影響很小。細(xì)胞外基質(zhì)中除含有膠原、蛋白多糖、氨基聚糖外，還含有多種活性蛋白和生長(zhǎng)因子，例如成骨細(xì)胞ECM中含有骨鈣素、骨橋蛋白、骨連接蛋白、骨涎蛋白等[29]，這些活性因子可能在促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化方面起重要作用。在以后的工作中，我們將進(jìn)一步檢測(cè)ECM中的活性成分。

在本研究中，包被在培養(yǎng)板上的這兩種細(xì)胞外基質(zhì)有不同的生物活性，成纖維細(xì)胞的胞外基質(zhì)可促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖，但對(duì)細(xì)胞骨向分化影響不大；成骨細(xì)胞的胞外基質(zhì)含BMP-2，對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響較小，但可促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞骨向分化。這兩種不同的細(xì)胞在體外形成的細(xì)胞外基質(zhì)，具有不同的生物活性。成骨細(xì)胞在體外形成的ECM適合應(yīng)用于骨組織和細(xì)胞工程，而心肌成纖維細(xì)胞在體外形成的 ECM 應(yīng)該適用于心肌組織和細(xì)胞工程，我們將在以后的研究中進(jìn)一步證實(shí)。

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