董巖巖 張燕婕 黃遵錫 周峻沛 唐湘華 李俊俊

α-半乳糖苷酶能專一性催化α-D-半乳糖苷鍵的水解，可以作用于具有α-半乳糖苷結(jié)構(gòu)的碳水化合物，故稱α-半乳糖苷酶。具有α-D-半乳糖苷鍵結(jié)構(gòu)的碳水化合物稱α-半乳糖苷類物質(zhì)。由于單胃動(dòng)物腸道內(nèi)缺乏α-半乳糖苷酶，所以α-半乳糖苷類物質(zhì)在小腸內(nèi)不能被消化、吸收，進(jìn)入大腸后，其被大腸桿菌等微生物發(fā)酵利用，產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸及CO2、H2和少量的CH4氣體，引起脹氣、嘔吐、下痢等現(xiàn)象，因此，α-半乳糖苷類物質(zhì)又稱抗?fàn)I養(yǎng)因子。在飼料中添加α-半乳糖苷酶，不僅可以降解不溶性的低聚糖，同時(shí)還可以消除腸道的脹氣現(xiàn)象，增加動(dòng)物的采食量。因此，對(duì)α-半乳糖苷酶在飼用添加劑中的研究具有非常重大的意義[1-5]。此外，α-半乳糖苷酶在醫(yī)藥、食品工業(yè)等領(lǐng)域也有廣泛應(yīng)用，特別是近年來(lái)α-半乳糖苷酶在血型改造、異種器官移植及法布里病等方面的應(yīng)用，顯示出誘人的前景[6-9]。為了滿足人們生產(chǎn)生活的要求，針對(duì)微生物易培養(yǎng)、繁殖快、產(chǎn)物易收集和提純等特點(diǎn)，我們選擇研究微生物源的α-半乳糖苷酶。

由于本試驗(yàn)中的α-半乳糖苷酶是作為酶制劑應(yīng)用到飼料中，所以需要對(duì)該酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的研究。在飼料加工過(guò)程中不可避免地出現(xiàn)的高溫，如制粒、膨化過(guò)程中的溫度可達(dá)70～150℃以上[10]，從而對(duì)酶制劑的應(yīng)用效果產(chǎn)生影響，因此就需要進(jìn)行酶的熱穩(wěn)定性的研究。在消化道中，胃的pH值為2.0～3.0，酶在體內(nèi)起催化作用的部位是小腸，其pH值為6.0左右[11]，因此就需要對(duì)該酶進(jìn)行pH值耐受性研究。作為飼料，還要添加多種無(wú)機(jī)離子，對(duì)酶活性有一定的影響，所以還需要研究金屬離子對(duì)酶活的影響。

綜合目前有關(guān)微生物源α-半乳糖苷酶方面的文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，不同菌種，或同一菌種在不同培養(yǎng)條件下產(chǎn)酶水平相差較大，酶學(xué)性質(zhì)也有差別，其中霉菌類的產(chǎn)酶水平最高。因此，利用篩選培養(yǎng)基獲得酶活力較高的一株霉菌并對(duì)其所產(chǎn)的α-半乳糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步探討，旨在為α-半乳糖苷酶在飼料與食品中的應(yīng)用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

不同豆制品作坊附近的土樣。

1.1.2 主要試劑

對(duì)硝基酚、對(duì)硝基酚-α-D-吡喃半乳糖苷（pNPG）2 mmol/l、檸檬酸—磷酸氫二鈉緩沖液（pH值3.0～8.0）、Tris堿、SDS、EDTA、PCR試劑。

1.1.3 主要儀器

實(shí)驗(yàn)室專用超純水機(jī)CRM-420型、電子天平PL203型、隔水式電熱恒溫箱PYX.DHS型、電熱烘干箱101-2型、分光光度計(jì)JH722s型、數(shù)顯恒溫水浴鍋Hll-2型、小型臺(tái)式高速離心機(jī)SW-CJ-2FD型、搖床HZ-9310K型、基因擴(kuò)增儀EDC-810等。

1.1.4 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基為（g/100 ml）：PDA培養(yǎng)基。

初篩培養(yǎng)基為（g/100 ml）：Peptone 0.1、NaCl 0.1、豆粕0.5、樣品1、瓊脂1.6，dH2O 100 ml。

復(fù)篩培養(yǎng)基為（g/100 ml）：棉籽糖0.5、(NH4)2SO40.5、瓊脂1.6，dH2O 100 ml。

發(fā)酵培養(yǎng)基為（g/100 ml）：豆粕2、(NH)2SO42、KH2PO40.2、MgSO4·7H2O 0.2，dH2O 100 ml。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)α-半乳糖苷酶菌株的篩選

在無(wú)菌條件下，用無(wú)菌雙蒸水對(duì)樣品進(jìn)行逐級(jí)梯度稀釋（10-1～10-7），吸取10-5、10-6及10-73個(gè)梯度各100 μl溶液分別涂布初篩固體培養(yǎng)基上，30℃下培養(yǎng)4～7 d；用接種環(huán)將培養(yǎng)出的不同菌種從初篩培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接到復(fù)篩培養(yǎng)基上培養(yǎng)，檢測(cè)其是否具有α-半乳糖苷酶活性；然后將有α-半乳糖苷酶活性的菌株在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分離，并按上述方式重復(fù)純化兩次后得到純菌株；將純化后的菌種依次轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min的條件下培養(yǎng)一定的時(shí)間后，對(duì)其發(fā)酵液進(jìn)行α-半乳糖苷酶酶活測(cè)定；將有活性的菌株加入15%（v/v）甘油后，于-70℃下保存。

1.2.2 酶活力測(cè)定pNPG法

1.2.2.1 原理

利用對(duì)硝基酚-α-D-吡喃半乳糖（pNPG）與α-半乳糖苷酶反應(yīng)后，生成有色物質(zhì)對(duì)硝基苯酚（pNPH），測(cè)定其含量即可計(jì)算出酶活。

1.2.2.2 方法

先加400 μl 2 mmol/l底物pNPG和500 μl緩沖液，在55℃、pH值5.0條件下預(yù)熱5 min，再加入100 μl酶液反應(yīng)10 min后，加0.5 mol Na2CO35 ml終止反應(yīng)，在405 nm下測(cè)定OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式計(jì)算酶活力。

1.2.2.3 酶活單位定義

在一定條件下，每分鐘分解底物生成1 μmol對(duì)硝基酚所需的酶量為一個(gè)α-半乳糖苷酶酶活單位(IU/ml)。

1.2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

以吸光值為橫坐標(biāo)，對(duì)硝基苯酚含量為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，每組設(shè)三個(gè)平行，充分搖勻后于405 nm處比色，0號(hào)管為對(duì)照管。

對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制見(jiàn)表1。

表1 對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.3 D-1基因組總DNA的提取

①將菌種接種于30 ml的PDA液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)2～3 d；

②滅菌紗布過(guò)濾得菌絲球，用無(wú)菌水沖洗菌絲球2次；

③加入液氮研磨3次后，立即加入提取緩沖液，65℃裂解5 min，12 000 r/min離心10 min，取上清；

④上清液等體積與氯仿混勻，上下?lián)u勻2次，12 000 r/min離心10 min，取上清；

⑤重復(fù)步驟④；

⑥上清液加1/10體積的醋酸鈉（3 mol/l，pH值5.2）和2倍體積的無(wú)水乙醇，-70℃放置2 h，4℃、12 000 r/min，離心20 min，沉淀；

⑦加1 ml 70%的乙醇洗鹽，4℃、12 000 r/min，離心10 min，重復(fù)一次；

⑧37℃開(kāi)蓋放置10～20 min控干；

⑨加入30 μl TE-RNaseA，37℃放置30 min以上，取5 μl提取物于0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取效果，剩余的提取物-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 D-1 18SrDNA PCR擴(kuò)增體系及條件

以提取的D-1基因組為模板，用真菌的ITS1和ITS4引物來(lái)擴(kuò)增D-1的18S rDNA，引物序列為：

ITS1:5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’

ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

取5 μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)。

擴(kuò)增體系為無(wú)菌ddH2O 35.5 μl；10×PCR緩沖液5.0 μl；dNTP混合液（2.5 mmol/l）4.0 μl；引物ITS1（10 pmol/l）2 μl；引物ITS4（10 pmol/l）2 μl；模板DNA 1 μl；TaqDNA聚合酶0.5 μl；總體積50 μl。

擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性4 min、94℃變性30 s、52℃退火30 s、72℃延伸1 min，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

1.2.5 酶學(xué)特性的研究

1.2.5.1 溫度對(duì)酶活性的影響

以pNPG為底物，在pH值5.5，不同溫度(20、30、35、40、45、50、55、60、70、80℃)下反應(yīng)10 min，測(cè)定相同的酶液在不同的溫度下所具有的酶活力單位，酶活最高的為最適反應(yīng)溫度。

1.2.5.2 pH值對(duì)酶活性的影響

以pNPG為底物，溫度為55℃，不同pH值條件（3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.4、7.0、8.0）下反應(yīng)10 min，測(cè)定相同的酶液所具有的酶活力單位，酶活最高的為最適反應(yīng)pH值。

1.2.5.3 α-半乳糖苷酶的pH值穩(wěn)定性

將原酶液在不同pH值（3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.4、7.0、8.0）的緩沖液中于37℃下保溫1 h，在最適條件下測(cè)定酶殘余活性以研究酶的pH值穩(wěn)定性。以未處理的酶液的酶活為100%計(jì)。

1.2.5.4 α-半乳糖苷酶的熱穩(wěn)定性

將原酶液在不同溫度（40、50、55、60℃）保溫30、60 min，在最適條件下測(cè)定酶殘余活性以研究酶的熱穩(wěn)定性。以未處理的酶液的酶活為100%計(jì)。

1.2.5.5 金屬離子對(duì)酶活力的影響

用濃度為0.01 mol/l的金屬離子Mg2+、Na+、Ca2+、K+、Fe3+、Al3+、Co2+、Cu2+、Zn2+、Pb2+、Mn2+、EDTA分別與原酶液以1∶1的比例進(jìn)行混合，37℃保存1 h后，分別在最適條件下進(jìn)行酶活的測(cè)定。以未處理的酶液的酶活為100%計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶活力計(jì)算公式

根據(jù)pNPH標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)圖1）得到回歸方程，從而得到α-半乳糖苷酶酶活力。

酶活力（IU/ml）=（0.350 4X+0.000 4）×n/（T×V）。式中：X——吸光度；

n——酶液稀釋倍數(shù)；

V——稀釋后反應(yīng)中的加酶量(ml)；

T——酶-底物反應(yīng)時(shí)間(min)。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 產(chǎn)α-半乳糖苷酶菌種的篩選（見(jiàn)圖2）

利用篩選培養(yǎng)基從20個(gè)不同豆制品作坊附近的土樣中篩選得到7株產(chǎn)α-半乳糖苷酶的菌株（如圖2），從中選取一株產(chǎn)α-半乳糖苷酶酶活最高的菌株D-1并進(jìn)行酶學(xué)特性研究。

圖2 不同菌株酶活力的比較

2.3 α-半乳糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

2.3.1 溫度對(duì)酶活力的影響（見(jiàn)圖3）

在不同溫度梯度、pH值5.5的條件下，以pNPG為底物，反應(yīng)10 min后，測(cè)定酶活。結(jié)果如圖3，酶活性隨溫度的升高而提高，在最適反應(yīng)溫度處酶活力最高，超過(guò)這一溫度，酶活力便急劇下降。因此，α-半乳糖苷酶的最適作用溫度為55℃，當(dāng)溫度超過(guò)55℃，酶活顯著降低。

圖3 溫度對(duì)酶活力的影響

2.3.2 pH值對(duì)酶活力的影響（見(jiàn)圖4）

圖4 pH值對(duì)酶活力的影響

在不同pH值、55℃條件下，以pNPG為底物，反應(yīng)10 min后，測(cè)定酶活。結(jié)果如圖4，α-半乳糖苷酶在pH值3.0～5.5之間表現(xiàn)較高的酶活力，說(shuō)明該酶較耐酸，并且其反應(yīng)最適pH值為5.0左右。堿性條件則不同程度地抑制酶活。

2.3.3 α-半乳糖苷酶的pH值穩(wěn)定性（見(jiàn)圖5）

圖5 α-半乳糖苷酶的pH值穩(wěn)定性

由于動(dòng)物消化道食糜的pH值變化范圍比較大，所以單純考慮在某一pH值條件下的酶活值并不全面，最好能測(cè)定該酶在比較廣泛的pH值范圍內(nèi)的酶活表現(xiàn)。因此，將酶液在不同pH值的緩沖液中于37℃下保溫1 h，在55℃、pH值5.0條件下測(cè)定酶殘余活性。結(jié)果如圖5，表明在pH值3.0～5.5范圍內(nèi)保持64.1%以上的酶活,其中在pH值5.0條件下耐受1 h酶活只下降了11%左右。在消化道中，胃的pH值為2.0～3.0左右，酶在體內(nèi)起催化作用的部位是小腸，其pH值為5.0～6.0左右。所以該酶在動(dòng)物腸道中可發(fā)揮其作用，能很好的應(yīng)用到動(dòng)物飼料中。

2.3.4 α-半乳糖苷酶的熱穩(wěn)定性（見(jiàn)圖6、圖7）

圖6 α-半乳糖苷酶的熱穩(wěn)定性

圖7 α-半乳糖苷酶的熱穩(wěn)定性(70℃)

將酶液分別在45、50、55、60℃下，保溫30、60 min，隨著溫度的升高和放置時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活保留率降低（如圖6），在60℃以下存放穩(wěn)定性較好。在45、50、55℃中耐受30 min至60 min，酶活下降趨勢(shì)平緩。60℃保溫0.5 h，酶活剩余44.6%，60℃保溫1 h，酶活剩余37.2%。此外，還做了在70、80℃下的耐受性試驗(yàn)，70℃下1 min時(shí)酶活剩余67.2%，2 min后酶活完全消失（如圖7），80℃下酶活完全消失，說(shuō)明該菌產(chǎn)的酶不夠耐熱。飼料加工制粒、膨化過(guò)程中的溫度可達(dá)70～150℃以上，所以飼料加工時(shí)可在加熱后進(jìn)行添加，如制成液體酶制劑于飼料調(diào)質(zhì)制粒后在顆粒表面進(jìn)行噴涂。

2.3.5 金屬離子對(duì)酶活力的影響（見(jiàn)圖8）

圖8 金屬離子對(duì)酶活力的影響

原酶液在不同種類的金屬離子中耐受1 h后，大多數(shù)金屬離子對(duì)α-半乳糖苷酶均具有不同程度的抑制作用，其中Cu2+和Fe3+的抑制作用較為明顯，而Ca2+、EDTA、Zn2+對(duì)α-半乳糖苷酶有一定的促進(jìn)作用，所以在添加酶制劑時(shí)盡量避免與鐵器、銅器長(zhǎng)時(shí)間接觸。

2.4 D-1基因組DNA的提?。ㄒ?jiàn)圖9）

提取的D-1基因組DNA經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果，說(shuō)明提取的總DNA純度良好。

圖9 D-1基因組DNA電泳圖

2.5 D-1 18S rDNA基因獲得

用D-1的基因組DNA為模板進(jìn)行18S rDNA PCR，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖10，PCR擴(kuò)增所產(chǎn)生的DNA片段為單一條帶，片段大小在600 bp左右。

圖10 D-118S rDNA的擴(kuò)增片段

2.6 D-1 18S rDNA基因的序列分析及進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建（見(jiàn)圖11）

測(cè)序得到完整的18S rDNA序列，將此序列與NCBI上已有序列進(jìn)行Blast比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其18S rDNA與多數(shù)Aspergillus niger同源性達(dá)到99%，用MEGA4和BioXM對(duì)目的序列進(jìn)行比對(duì)和聚類分析構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，從圖11可以看出，D-1與Aspergillus niger聚為一類，且與Aspergillus niger AB369898.1有最大的同源性，遺傳距離幾乎為0，因此可初步確定D-1屬于Aspergillus niger。

3 討論

在關(guān)于產(chǎn)α-半乳糖苷酶的微生物的文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)，霉菌等真菌類微生物的α-半乳糖苷酶的產(chǎn)量較高，因此，本研究直接從樣品中篩選真菌，篩選出酶活最高的一株霉菌D-1，通過(guò)對(duì)D-1進(jìn)行液體發(fā)酵獲得原酶液的最大酶活為3.48 IU/ml，將粗酶液進(jìn)行離心后對(duì)其進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的研究。

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，該酶的最適反應(yīng)溫度是55℃，最適反應(yīng)pH值為5.0，與已報(bào)道的黑曲霉α-半乳糖苷酶的最適反應(yīng)溫度是60℃，最適反應(yīng)pH值為4.5的結(jié)果有差異[12]。該酶在液體狀態(tài)下熱穩(wěn)定性較好，60℃以下條件都很穩(wěn)定，在70、80℃下的耐受性差，說(shuō)明該菌產(chǎn)的α-半乳糖苷酶不夠耐熱，飼料加工時(shí)可在制粒后進(jìn)行液體噴涂[13]；在pH值3.0～5.5范圍內(nèi)保持64.1%以上的酶活，其中在pH值5.5條件下耐受1 h酶活只下降了11%左右，因此，此酶可以應(yīng)用于動(dòng)物飼料中。在金屬離子及EDTA對(duì)酶活影響的試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)Ca2+、EDTA、Zn2+對(duì)α-半乳糖苷酶有一定的促進(jìn)作用，而Cu2+和Fe3+的抑制作用較為明顯，所以在添加酶制劑過(guò)程中盡量避免與鐵器、銅器長(zhǎng)時(shí)間接觸。

圖11 菌株NJY-1 18S rDNA的進(jìn)化樹(shù)

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