王祥財(cái),廖長(zhǎng)風(fēng),張庭龍,梁 艷,李海亮,黃 莉,劉禮平,許明君,李樹(shù)芳

(江西贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,江西贛州341000;1.血液腫瘤科;2.血液病實(shí)驗(yàn)室）

Real Time PCR(CR-T PCR）是近年研制出的一種核酸定量技術(shù),定量范圍在0-1013基因拷貝/L,在檢測(cè)微小殘留病灶較其他方法精確、簡(jiǎn)捷[1],尤其適合于bcr/abl陽(yáng)性白血病,診斷慢性粒細(xì)胞白血病(CML）療效觀察、預(yù)后判斷等動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè),我們采用熒光定量Real Time PCR反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)39例CML及其它血液性疾病20例的bcr/abl融合基因表達(dá)水平,并對(duì)其結(jié)果進(jìn)行探討分析,現(xiàn)報(bào)導(dǎo)如下。

1 材料與方法

1.1 對(duì)象

1.1.1 選擇2006-2009年我院門(mén)診及住院的慢性粒細(xì)胞白血病患者39例,其中男性24例,女性15例,年齡最小16歲,年齡最大 79歲,平均年齡40.6歲,所有病例均按血液病診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]明確診斷,其中加速期9例,急變期2例,慢性期28例。

1.1.2 選擇同期診斷的各種血液病患者20例作為對(duì)照,其中真性紅細(xì)胞增多癥3例,原發(fā)性血小板增多癥1例,急性粒細(xì)胞白血病2例,特發(fā)性血小板減少性紫癜5例、缺鐵性貧血5例,巨幼細(xì)胞性貧血4例。

1.2 方法

1.2.1 提取 取新鮮外周血5 ml或骨髓血2 ml,肝素抗凝,加入等體積生理鹽水稀釋,經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll,相對(duì)密度1.077）分離,1 500 r/min離心10 min,取界面層單個(gè)核細(xì)胞(MNC）,PBS洗滌 1-2次。

采用TRIZOL(Gibco-BRL）一步法提取RNA,紫外線分光光度計(jì)測(cè)定260-280 nm波長(zhǎng)處的吸光度值,并計(jì)算RNA含量。-20℃保存。

1.2.2 引物及探針設(shè)計(jì)、合成bcr/abl融合基因,上游引物(CML-A）:5′-CTTCTCCCTGGCATCCGTGGA-3′;下游引物(CML-B）:5′-TGCAACGAAAAGGTTGGGGT-3′,分別設(shè)計(jì)在兩個(gè)基因的exon 2,防止漏檢。按照Real Time PCR探針設(shè)計(jì)要求,CML探針(CML-C）:5′-TTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAAGCC-3′,其中在 5′端標(biāo)記上熒光發(fā)光基團(tuán)FAM,3′端標(biāo)記上熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。上述引物及探針均由上海Sangon生物工程公司合成。

1.2.3 cDNA 合成和 Real Time RT-PCR 取2 μ g總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到備用cDNA。10倍稀釋定量模板制備梯度標(biāo)準(zhǔn)品。測(cè)控管與參控管的PCR反應(yīng)體系為cDNA模板或定量標(biāo)準(zhǔn)品5.0 μ L、PCR反應(yīng)混合液為 44.0 μ L、Tag 聚合酶 1.0 μ L,反應(yīng)終體積為50.0 μ L。各反應(yīng)管置PE5700型Real Time PCR儀中(第一孔為空白對(duì)照管或陰性對(duì)照）進(jìn)行擴(kuò)增。循環(huán)參數(shù)為:93℃預(yù)變性 2 min,然后93℃45 s,55℃55 s共40個(gè)循環(huán),最后置33℃保溫。反應(yīng)過(guò)程中實(shí)時(shí)檢測(cè)擴(kuò)增過(guò)程中的激發(fā)熒光強(qiáng)度變化,計(jì)算機(jī)作出定量結(jié)果及定量曲線。最終獲得bcr/abl mRNA的拷貝數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理采用SPSS14.0英文版軟件,將39例患者起始資料錄入,建立數(shù)據(jù)集。對(duì)相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行聚類(lèi)分析及相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 慢性粒細(xì)胞白血病患者實(shí)時(shí)監(jiān)控次數(shù)2-7次,平均4.1次。

2.2 所有對(duì)照組病例檢測(cè)均為陰性,慢性粒細(xì)胞白血病患者39例第一次檢測(cè)均為陽(yáng)性,拷貝數(shù)3.61×103-7.14×107,平均值5.83×105。

2.3 先對(duì)骨髓、血分析等相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行聚類(lèi)分析,選用系統(tǒng)聚類(lèi)中的R型聚類(lèi)方法,聚類(lèi)參數(shù)(類(lèi)間相似系數(shù)）選用最大相似系數(shù)法。結(jié)果:從聚類(lèi)的冰柱圖可以看出指標(biāo)共聚成三類(lèi),每類(lèi)包含一組指標(biāo)。由聚類(lèi)全過(guò)過(guò)程中可以直觀的看出聚類(lèi)變化的全過(guò)程。根據(jù)聚類(lèi)樹(shù)形圖類(lèi)間的密切程度,結(jié)合醫(yī)學(xué)知識(shí),這些指標(biāo)分為三類(lèi),第一類(lèi):包含骨髓嗜堿、外周血嗜堿;第二類(lèi):包含粒系總數(shù)、骨髓早幼粒、外周血早幼粒;第三類(lèi):骨髓原始、外周血原始。

2.4 變量間的相關(guān)分析 對(duì)39例CML患者“骨髓原始”與“bcr/abl mRNA的拷貝數(shù)”之間進(jìn)行簡(jiǎn)單線性相關(guān)分析,顯示兩變量之間有一定的相關(guān)性,Pearson相關(guān)系數(shù)r為 0.42,假設(shè)檢驗(yàn)的P值=0.017＜0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)第一類(lèi)、第二類(lèi)與bcr/abl mRNA的拷貝數(shù)之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 慢性期病人經(jīng)口服羥基脲±干擾素治療,加速期或急變期病人經(jīng)靜脈化療后,拷貝數(shù)均有下降,但未見(jiàn)轉(zhuǎn)陰。慢性期病人經(jīng)口服羥基脲±干擾素治療后,拷貝數(shù)均有下降,其中6例出現(xiàn)再度上升后進(jìn)展為加速期或急變期,拷貝數(shù)較骨髓檢查可提前2-4個(gè)月預(yù)示。

2.6 經(jīng)格列衛(wèi)治療5例和干細(xì)胞移植后1例bcr/abl拷貝數(shù)呈明顯下降,其中4例至轉(zhuǎn)陰,1例(慢性期轉(zhuǎn)急變期患者）下降后未轉(zhuǎn)陰,又呈上升趨勢(shì)。

3 討論

近年來(lái)研究證實(shí)bcr/abl融合基因,其分子生物學(xué)基礎(chǔ)是位于9號(hào)染色體上的c-abl癌基因與位于22號(hào)染色體上的bcr基因形成bcr/abl融合基因。它編碼P210等融合蛋白,它的表達(dá),提高了abl基因酪氨酸蛋白激酶的活性,改變了細(xì)胞多種蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化水平和細(xì)胞微絲肌動(dòng)蛋白的功能,從而擾亂了細(xì)胞內(nèi)正常的信號(hào)傳導(dǎo)途徑,使細(xì)胞失去了對(duì)周?chē)h(huán)境的反應(yīng)性,并抑制了凋亡的發(fā)生。Ph染色體是對(duì)CML有特殊診斷價(jià)值的標(biāo)志染色體,見(jiàn)于90%-95%的CML病人,還有5%-10%的病例用遺傳學(xué)方法不能顯示其存在,而bcr/abl融合基因的檢測(cè)陽(yáng)性率達(dá)99%[3],說(shuō)明分子生物學(xué)技術(shù)比遺傳學(xué)方法更敏感,可以從分子水平為部分Ph陰性的CML提供診斷,從而對(duì)治療的選擇和預(yù)后產(chǎn)生重要影響。

本組檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),臨床診斷CML患者均為陽(yáng)性,且對(duì)照組均為陰性,盡管有報(bào)道在某些慢性骨髓增殖性疾病存在一定陽(yáng)性率(10%-17.6%）[4],但本組試驗(yàn)均未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果,認(rèn)為bcr/abl融合基因是慢性粒細(xì)胞性白血病的特異性標(biāo)志,在診斷中起著決定性作用。

對(duì)病人血液及骨髓結(jié)果相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行聚類(lèi)分析,從聚類(lèi)的冰柱圖可以看出指標(biāo)共聚成三類(lèi),第一類(lèi):包含骨髓嗜堿、外周血嗜堿;第二類(lèi):包含粒系總數(shù)、骨髓早幼粒、外周血早幼粒;第三類(lèi):骨髓原始、外周血原始。變量間的相關(guān)分析,第三類(lèi)指標(biāo)與bcr/abl融合基因拷貝數(shù)有顯著相關(guān)性,說(shuō)明bcr/abl融合基因能直接反映疾病的嚴(yán)重程度及其本質(zhì),目前的慢性粒細(xì)胞白血病分期也主要依賴(lài)于原始細(xì)胞和數(shù)量。

本組病例中有5例應(yīng)用格列衛(wèi)治療(分別處于慢性期及急變期）和1例經(jīng)過(guò)干細(xì)胞移植后患者,其中4例治療后達(dá)到分子學(xué)水平緩解,在血液或骨髓中未檢出bcr/abl融合基因,但是1例慢性期CML患者應(yīng)用格列衛(wèi)后未能下降至陰性,2個(gè)月后骨髓細(xì)胞學(xué)檢查亦提示未見(jiàn)緩解,說(shuō)明CML患者對(duì)格列衛(wèi)治療反應(yīng)并不都有效,部分患者不能達(dá)到分子學(xué)緩解提示預(yù)后不良,這時(shí)對(duì)bcr/abl融合基因進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控尤為重要,能更早提示預(yù)后情況,準(zhǔn)確判斷藥物療效[5]。

由此可見(jiàn)Real Time PCR監(jiān)測(cè)bcr/abl融合基因?qū)γ鞔_診斷慢性粒細(xì)胞白血病有重要價(jià)值,同樣是慢性粒細(xì)胞白血病治療和預(yù)后觀察的決定性指標(biāo),有條件的醫(yī)院值得推廣應(yīng)用,是CML的進(jìn)一步研究的重要手段。

[1]Van der Velden V H,Hochhaus A,Cazzaniga G,et al.Detection of minimal residual disease in hematologic malignancies by real-time quantitative PCR:principles,approaches,and laboratory aspects[J].Leukemia,2003,17:1013.

[2]張之南,沈 悌,主編.血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[M].第3版.北京科學(xué)出版社,2007,134-138,87-91.

[3]Kantarjian HM,Cortes JE,O'Brien S,et al.Long-ter m survival benefit and improved complete cytogenetic andmolecular response rates with imatinib mesylate in Philadephia chromosome positve chronic phase chronic myeloid lekemia after failure of interferonalpha[J].Blood,2004,104(7）:1979.

[4]賀韋東,郭成山.bcr-abl融全基因在骨髓增殖性疾病中的表達(dá)及其臨床意義[J].臨床血液學(xué)雜志,2006,19(5）:303.

[5]Emig M,Sausscle S,WittorH,et al.Accurate and rapid analysis of residual in patientswith CML using specific fluorescent hybridization probes for real time quantitative RT-PCR[J].Leukemia,1999,13:1825.