蘇惠春 孫婧 羅陽 韓悅 劉笑純 張警兮 溫禾 姚煦 王寶璽

210042南京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病醫(yī)院過敏與風(fēng)濕免疫科［蘇惠春（現(xiàn)在福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科，350004福州）、孫婧（現(xiàn)在北京大學(xué)人民醫(yī)院皮膚科）、羅陽、韓悅、劉笑純、張警兮、溫禾、姚煦］；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 整形外科醫(yī)院皮膚科（王寶璽）

·論著·

特應(yīng)性皮炎患者血清轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2特異性IgE水平與病情相關(guān)性研究

蘇惠春 孫婧 羅陽 韓悅 劉笑純 張警兮 溫禾 姚煦 王寶璽

210042南京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病醫(yī)院過敏與風(fēng)濕免疫科［蘇惠春（現(xiàn)在福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科，350004福州）、孫婧（現(xiàn)在北京大學(xué)人民醫(yī)院皮膚科）、羅陽、韓悅、劉笑純、張警兮、溫禾、姚煦］；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 整形外科醫(yī)院皮膚科（王寶璽）

目的檢測(cè)特應(yīng)性皮炎（AD）患者血清中轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2（TG2）特異性IgE（sIgE）的表達(dá)水平，并分析與患者病情的相關(guān)性。方法共入組77例AD患者，其中，44例≥12歲，33例＜12歲，內(nèi)源性AD（特異性sIgE陰性，且總IgE＜150 kU/L）20例，外源性AD（一種以上的外源性過敏源sIgE++以上，或總IgE≥150 kU/L）49例。采用免疫捕獲及生物素標(biāo)記的酶聯(lián)免疫分析法檢測(cè)77例AD患者、40例成人尋常性銀屑病患者和30例成人健康對(duì)照血清中TG2 sIgE水平。記錄AD患者年齡、病程、SCORAD評(píng)分、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)和總IgE及TG2的sIgE水平。結(jié)果≥12歲AD組、＜12歲AD組、銀屑病組和對(duì)照組外周血TG2 sIgE水平（A450）分別為1.02±0.2、1.04±0.044、0.93±0.25、0.71±0.13?！?2歲AD、尋常性銀屑病和健康對(duì)照組外周血中TG2 sIgE表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=37.407，P＜0.001）；兩兩組間比較發(fā)現(xiàn)，≥12歲AD組、銀屑病組TG2 sIgE水平均顯著高于對(duì)照組（t值分別為7.38、4.83，均P＜0.001）。內(nèi)源性AD組TG2 sIgE水平（1.16±0.03）高于外源性AD組（1.02± 0.20）（t=2.27，P=0.02）。AD患者組TG2 sIgE水平與年齡、病程、SCORAD評(píng)分、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、血清總IgE水平均無顯著相關(guān)性（r值分別為0.03、0.14、-0.04、-0.08和0.06，均P＞ 0.05）。結(jié)論AD患者血清中TG2 sIgE水平明顯升高，TG2可能是AD患者的一種自身抗原，但TG2 sIgE與患者的病情嚴(yán)重程度無明顯相關(guān)性。

皮炎，特應(yīng)性；轉(zhuǎn)谷酰胺酶；免疫球蛋白E；自身抗原；疾病嚴(yán)重程度指數(shù)

特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis，AD）發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，皮膚屏障功能缺陷［1］、皮膚微生物菌群失調(diào)［2］、Th1/Th2/Th22免疫失調(diào)以及自身變態(tài)反應(yīng)均是重要發(fā)病機(jī)制［3］。自身變態(tài)反應(yīng)是特應(yīng)性疾病患者針對(duì)自身抗原產(chǎn)生特異性IgE（sIgE）抗體的一種異常免疫應(yīng)答反應(yīng)［4］。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的自身變應(yīng)原有至少140余種［5］。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（transglutaminase，TG）是一種鈣離子依賴性蛋白酶，參與形成表皮屏障等多種生物活動(dòng)［6］。鑒于大多數(shù)AD患者存在皮膚屏障功能異常，我們推測(cè)除絲聚合蛋白外，作為皮膚屏障主要蛋白之一的TG2可能也參與AD發(fā)病。為此我們檢測(cè)AD患者血清中TG2 sIgE，并分析與疾病嚴(yán)重度相關(guān)指標(biāo)，探討自身變態(tài)反應(yīng)在AD發(fā)病中的作用。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

AD組77例，其中＜12歲33例，≥12歲44例，AD診斷采用Williams標(biāo)準(zhǔn)，所有患者就診前1個(gè)月未接受系統(tǒng)糖皮質(zhì)激素或其他免疫抑制劑治療，2周內(nèi)未服用抗組胺藥物或外用強(qiáng)效糖皮質(zhì)激素治療；≥12歲AD組中，男17例，女27例，年齡12～58（25.42±12.48）歲；＜12歲AD組33例中，男15例，女18例 ，年齡1～11（5.63±3.02）歲。尋常性銀屑病組中，男22例，女18例，年齡18～55（27.08±6.08）歲。30例健康對(duì)照組中，男8例，女22例，年齡20～55（28.57± 6.30）歲。≥ 12歲AD組、銀屑病組和對(duì)照組間性別（χ2=5.878，P=0.053）、年齡（F=1.513，P=0.225）差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

根據(jù)血清總IgE和sIgE的水平將AD分為內(nèi)源性AD（特異性sIgE陰性，且總IgE＜150 kU/L）和外源性AD（一種以上的外源性過敏源sIgE++以上，或總IgE ≥ 150 kU/L）［7］，其中內(nèi)源性AD 20例，女13例，男7例，年齡（19.1±17.71）歲；外源性AD 49例，女25例，男24例，年齡（14.86±12.21）歲。兩組之間性別（χ2=1.12，P=0.29）、年齡（t=0.47，P=0.64）差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

記錄AD患者病程、SCORAD評(píng)分（包括主客觀評(píng)分），測(cè)定血清中TG2 sIgE水平，其中66例計(jì)數(shù)外周血嗜酸性粒細(xì)胞，65例檢測(cè)血清中總IgE（≥150 kU/L為異常），50例檢測(cè)戶塵螨sIgE（ImmunoCAP 250檢測(cè)系統(tǒng)，美國賽默飛公司）。檢測(cè)銀屑病患者血清中TG2 sIgE水平。本研究已通過中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2015快審第KY009號(hào)），研究對(duì)象均簽署知情同意書。

二、材料和方法

1.材料：組織中TG2溶液（美國Fitzgerald公司，濃度1 g/L，相對(duì)分子質(zhì)量72 000），生物素EZ?Link Sulfo?NHS?Bitotin（美國Thermo Scientific公司），BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），包被有抗人IgE抗體的微孔板（德國福克公司）。

2.采用免疫捕獲聯(lián)合生物素標(biāo)記的酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清中TG2 sIgE水平：按說明書標(biāo)記生物素，取6.5 μl 10 mmol/L生物素加入到1 ml TG2中混勻，冰上放置2 h，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定生物素標(biāo)記的TG2蛋白濃度。向包被抗IgE抗體的微孔板中加入受試者血清50 μl，同時(shí)設(shè)陰性、陽性質(zhì)控及標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)試孔。每份血清測(cè)3個(gè)復(fù)孔，20～25℃孵育1 h；300 μl清洗液洗滌3次后加入生物素標(biāo)記4 mg/L的TG2溶液100 μl，陰性及陽性質(zhì)控孔中加入100 μl塵螨D1液體，封板，室溫孵育1 h；洗滌3次后加入100 μl鏈霉素親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶結(jié)合液，室溫孵育30 min；洗滌3次后每孔加入 100 μl底物 3，3′，5，5′?四甲基聯(lián)苯胺（TMB），37℃避光孵育20 min；最后加入100 μl 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀450 nm處讀取吸光度（A值）。

3.統(tǒng)計(jì)方法：采用GraphPad PRISM軟件作圖及SPSS17.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，組間性別比較采用卡方檢驗(yàn)，sIgE水平比較采用多組間非參數(shù)Kruskal?Wallis檢驗(yàn)，并使用Nemenyi進(jìn)行兩兩比較；內(nèi)外源性AD組間年齡、sIgE水平比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)；各指標(biāo)間的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、外周血TG2 sIgE表達(dá)水平比較

≥12歲AD組、＜12歲AD組、銀屑病組和對(duì)照組外周血TG2 sIgE水平（A450）分別為1.02±0.20、1.04±0.044、0.93±0.25和0.71±0.13。非參數(shù)Kruskal?Wallis檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，≥ 12歲AD組、銀屑病組和對(duì)照組外周血TG2 sIgE水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=37.407，P＜ 0.001），Nemenyi兩兩比較發(fā)現(xiàn) ≥12歲AD組、銀屑病組TG2 sIgE水平顯著高于對(duì)照組（t值分別為7.38、4.83，均P＜ 0.001），且 ≥ 12歲AD組高于銀屑病組（t=2.66，P=0.008）。

圖1 特應(yīng)性皮炎（AD）患者外周血血清中轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2（TG2）sIgE水平與年齡（1A）、病程（1B）、SCORAD 評(píng)分（1C）、外周血嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（1D）、總IgE（1E）的相關(guān)性分析 TG2 sIgE水平與上述指標(biāo)均無相關(guān)性

內(nèi)源性AD組TG2 sIgE表達(dá)水平為1.16±0.30，外源性AD組為1.02±0.20，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.372，P=0.02）。

二、AD患者TG2 sIgE水平與病情相關(guān)性分析

77例AD患者SCORAD評(píng)分39.73±16.11，外周血嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（0.34±0.30）×109個(gè)/L，總IgE（618.14±1 100.67）kU/L。Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，AD患者外周血TG2 sIgE水平與年齡、病程、SCORAD評(píng)分、外周血嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（65例）、總IgE水平（66例）均無顯著相關(guān)性（r值分別為0.03、0.14、-0.04、-0.08和 0.06，P值分別為 0.78、0.24、0.74、0.54和0.62）。見圖1。

討 論

自身變態(tài)反應(yīng)是近幾年逐漸被關(guān)注的AD新發(fā)病機(jī)制之一，AD的自身變態(tài)反應(yīng)機(jī)制研究證據(jù)包括：①AD患者血清存在針對(duì)某些自身抗原的sIgE抗體，而健康對(duì)照組則檢測(cè)不出［8?9］；②某些抗自身抗原的sIgE如抗磷脂抗體（ACL）、抗β2糖蛋白、rhMnSOD的sIgE表達(dá)水平與AD患者SCORAD評(píng)分呈正相關(guān)，具有自身抗原sIgE抗體的AD患者病情往往比未檢測(cè)到這些抗體的患者更為嚴(yán)重，而且AD患者病情發(fā)作時(shí)常可檢測(cè)到自身抗原sIgE升高［10］。

AD患者的自身過敏原大致可分為3類：①與外源性過敏原有交叉過敏的自身過敏原，如與樺樹抗原交叉過敏的肌動(dòng)蛋白；②與外源過敏原無關(guān)的自身過敏原，如Hom1?Hom5；③“經(jīng)典”的自身抗原：如Dsg1、BP180、核抗原等，這些抗原不僅可以誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性IgG，還可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生sIgE，并且與疾病活動(dòng)度相關(guān)［4］。有研究采用噬菌體表面展示技術(shù)構(gòu)建cDNA文庫，篩選出至少140種可與IgE結(jié)合的自身抗原與特應(yīng)性濕疹相關(guān)，TG2屬于其中的一種［5］。Currò等［11］用實(shí)時(shí)定量 RT?PCR 方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，慢性牙周炎患者病變組織TG2基因的表達(dá)水平高于健康人。我們發(fā)現(xiàn)，AD患者TG2 sIgE水平明顯高于對(duì)照組，內(nèi)源性AD患者TG2 sIgE水平高于外源性AD患者，并且其水平與總IgE及塵螨sIgE水平無關(guān)，推測(cè)TG2是一種與塵螨抗原無關(guān)的自身抗原。銀屑病是一種慢性炎癥性皮膚病，有研究發(fā)現(xiàn)銀屑病患者針對(duì)某些抗原的sIgE水平升高，但低于AD患者TG IgE水平［12］。我們發(fā)現(xiàn)尋常性銀屑病患者TG2 sIgE水平高于健康人，表明銀屑病患者體內(nèi)可能存在針對(duì)TG2的自身變態(tài)反應(yīng)。

自身抗原釋放機(jī)制包括以下幾個(gè)方面［13?14］：①外源性過敏原誘發(fā)皮膚炎癥反應(yīng)和引起表皮免疫損傷，如塵螨抗原中含有破壞皮膚屏障的蛋白酶；②瘙癢所致的搔抓引發(fā)皮膚機(jī)械性損傷，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白釋放；③皮損處局部微生物定植異常，導(dǎo)致慢性炎癥和組織損傷致使自身抗原釋放。自身抗原暴露后，刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)自身抗原的變態(tài)反應(yīng)。以往的研究提示，機(jī)體針對(duì)自身抗原的過敏反應(yīng)是AD炎癥頑固遷延的一個(gè)重要原因，外源性過敏原通過誘導(dǎo)Th2型免疫反應(yīng)引起急性炎癥，而自身過敏原更趨向于誘導(dǎo)Th1型反應(yīng)，引起腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素12表達(dá)升高，導(dǎo)致慢性炎癥反應(yīng)［15?16］。TG2主要分布在表皮基底層，推測(cè)AD患者表皮屏障破壞導(dǎo)致基底層TG2進(jìn)入真皮，引起下游免疫反應(yīng)及IgE抗體釋放，從而參與疾病發(fā)生和發(fā)展。我們未發(fā)現(xiàn)AD患者TG2 sIgE抗體水平與嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、SCORAD評(píng)分、總IgE等病情嚴(yán)重度指標(biāo)相關(guān)，這可能是因?yàn)槿虢M的樣本量偏小，或者TG2升高與別的因素相關(guān)，后期將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量。對(duì)于TG2 sIgE陽性患者，我們擬進(jìn)行隨訪，觀察同一患者病情變化與血清TG2 sIgE水平的關(guān)系，尋找其可能的發(fā)病機(jī)制。

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Relationship between the serum level of transglutaminase 2?specific IgE and disease condition in patients with atopic dermatitis

Su Huichun,Sun Jing,Luo Yang,Han Yue,Liu Xiaochun,Zhang Jingxi,Wen He,Yao Xu,Wang Baoxi
Department of Allergy and Rheumatology,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China（Su HC［current affiliation:Department of Dermatology,The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Fuzhou 350004,China］,Sun J［current affiliation:Department of Dermatology,Peking University People′s Hospital］,Luo Y,Han Y,Liu XC,Zhang JX,Wen H,Yao X）;Department of Dermatology,Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100144,China（Wang BX）

s:Yao Xu,Email:dryao xu@126.com;Wang Baoxi,Email:wangbx@ncstdlc.org

ObjectiveTo detect the serum level of transglutaminase 2（TG2）?specific IgE（sIgE）in patients with atopic dermatitis（AD）,and to analyze its correlation with the disease condition.MethodsA total of 77 patients with AD were enrolled into this study,including 44 patients aged≥12 years and 33 patients aged＜12 years.Of the 77 patients,20 were diagnosed with intrinsic AD,which was characterized by the absence of sIgE and total serum IgE values＜150 kU/L,and 49 with extrinsic AD characterized by positive（++）or even strongly positive sIgE for more than 1 kind of exogenous allergens,or total serum IgE values≥ 150 kU/L.Immunocapture?biotinylated detector enzyme immunoassay was performed to detect the serum level of TG2?sIgE in 77 patients with AD,40 adult patients with psoriasis vulgaris（PV）and 30healthy adult controls.Clinical data on the AD patients were recorded,including age,disease duration,SCORAD score,blood eosinophil count,levels of total IgE and TG2?sIgE.Results The serum levels of TG2?sIgE in AD patients aged≥12 years,AD patients aged＜12 years,PV patients and healthy controls were 1.02±0.2,1.04±0.044,0.93±0.25 and 0.71±0.13,respectively.Additionally,the serum level of TG2?sIgE significantly differed among AD patients aged ≥ 12 years,PV patients and healthy controls（χ2=37.407,P＜0.001）,and was significantly higher in both AD patients aged≥ 12 years and PV patients than in the healthy controls（t=7.38,4.83,respectively,bothP＜ 0.001）.Moreover,the intrinsic AD group showed significantly higher TG2?sIgE levels compared with the extrinsic AD group（1.16 ± 0.03vs.1.02 ±0.20,t=2.27,P=0.02）.The TG2?sIgE level was uncorrelated with the patients′age,disease duration,SCORAD score,blood eosinophil count or serum total IgE levels in AD patients（r=0.03,0.14,-0.04,-0.08,0.06,respectively,allP＞ 0.05）.ConclusionThe serum level of TG2?sIgE obviously increases in AD patients,so TG2 may be one kind of autoantigen in AD patients,but there is no significant correlation between the TG2?sIgE level and AD severity.

Dermatitis,atopic；Transglutaminases；Immunoglobulin E；Autoantigens;Severity of illness index

姚煦，Email：dryao_xu@126.com；王寶璽，Email：wangbx@ncstdlc.org

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.07.009

國家自然科學(xué)基金（81371735、81573045）；2014年亞美醫(yī)學(xué)基金會(huì)（MMAAP）皮膚病項(xiàng)目基金；江蘇省自然科學(xué)基金（BK20150166）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81371735,81573045）;Milstein Medical Asian American Partnership（MMAAP）Foundation Research Project Award in Skin Disease in 2014;Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China（BK20150166）

2016?10?09）

（本文編輯：尚淑賢）