戴赟 綜述 韓寶惠 審校

肺癌是最常見的惡性腫瘤，已成為人類因癌癥死亡的主要原因之一。在肺癌治療前明確腫瘤的類型十分重要，因?yàn)樗突颊叩膫€性化治療密切相關(guān)，并能為腫瘤的流行病學(xué)及生物學(xué)研究提供基礎(chǔ)。目前，肺癌按病理類型分型較多，而且根據(jù)某些形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)，肺癌中還有一些具有神經(jīng)內(nèi)分泌形態(tài)學(xué)的腫瘤，能較好地明確肺癌的病理類型及亞型，可以對這些異質(zhì)性肺癌的生物學(xué)特性的研究及開展個性化治療提供較多的臨床依據(jù)[1]。近年來發(fā)現(xiàn)，肺癌還伴有神經(jīng)內(nèi)分泌分化（neuroendocrine differentiation, ND），研究證實(shí)神經(jīng)內(nèi)分泌分化現(xiàn)象廣泛存在于前列腺、胃腸道、肺等部位的癌中。世界衛(wèi)生組織（World Health Organization, WHO）肺腫瘤組織病理學(xué)分類新增加了非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）伴神經(jīng)內(nèi)分泌分化的概念，由于對該類異質(zhì)性肺癌研究較少，許多學(xué)者都對其生物學(xué)特性和對化療的敏感性及對生存期的影響存在著爭議，本文就神經(jīng)內(nèi)分泌分化標(biāo)志物的選擇和檢測以及神經(jīng)內(nèi)分泌分化與NSCLC的化療療效、生存期的關(guān)系和相關(guān)的基因?qū)鴥?nèi)外的研究進(jìn)展作一綜述。

1 腫瘤的神經(jīng)內(nèi)分泌分化

惡性腫瘤有著許多特征，但基本特征之一是細(xì)胞的異常分化。在腫瘤細(xì)胞向不成熟方向退行性發(fā)育的過程中，可出現(xiàn)原來組織或器官中的正常細(xì)胞所沒有的新的分化特征或原有一些特征的丟失，這種分化不僅給腫瘤的診斷帶來困難，同時也給腫瘤治療造成了許多障礙。腫瘤組織內(nèi)的ND是指腫瘤組織中部分腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)ND現(xiàn)象，它不同于一般內(nèi)分泌腺腫瘤和神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤。腫瘤組織中這部分ND的腫瘤細(xì)胞為腫瘤組織的一種伴隨成分，和神經(jīng)內(nèi)分泌癌區(qū)別為按照WHO分類標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤組織中一種神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)記物明確陽性，且陽性細(xì)胞數(shù)＞50%時診斷為神經(jīng)內(nèi)分泌癌，否則為伴神經(jīng)內(nèi)分泌分化。惡性腫瘤細(xì)胞向ND方向分化，但它仍具有惡性特征，即在癌病灶中的ND細(xì)胞既顯示腫瘤主體細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，又顯示胞漿內(nèi)分泌顆粒。正常ND細(xì)胞具有類似神經(jīng)細(xì)胞的致密圓形胞體和大量細(xì)長而有分支的樹狀突起。在腺癌病灶中的ND細(xì)胞突起缺乏特征性。在低分化腺癌中ND細(xì)胞呈圓形、卵圓形或不規(guī)則形，極性消失，這些細(xì)胞的胞核與周圍腫瘤一樣具有明顯的異型性。在高分化腺癌中，ND細(xì)胞呈錐形或長條形，頂端朝向腺腔側(cè)，有時可見其突起抵達(dá)腔面[2,3]。

ND現(xiàn)象已經(jīng)在多種非神經(jīng)內(nèi)分泌器官中得到證實(shí)。由于分化的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞在癌組織成分中不足50%，且以單個細(xì)胞或細(xì)胞巢的形式分散存在，為癌組織的一種伴隨成分，被稱為癌伴神經(jīng)內(nèi)分泌分化，從而與神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤相區(qū)別。這些散在的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞與其所在器官原發(fā)癌的類型、分期、分級和預(yù)后關(guān)系密切。許多研究證實(shí)，神經(jīng)內(nèi)分泌分化現(xiàn)象廣泛存在于前列腺、胃腸道、肺等部位的腫瘤中。這些分化的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞可合成、分泌各種神經(jīng)肽或者胺類激素，致使血液中這些激素類物質(zhì)的水平升高，有時可因激素過剩引起相應(yīng)的神經(jīng)內(nèi)分泌癥狀，即副神經(jīng)內(nèi)分泌綜合征。除甲狀腺外，胃腸道、前列腺和乳腺、胰腺等組織的正常上皮中均含有神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞細(xì)胞。與正常神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的形態(tài)特征類似，分化的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞胞漿內(nèi)含有多種致密核心顆粒，它們與存貯和分泌大量內(nèi)分泌活性物質(zhì)有關(guān)[4]。

2 肺的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤

自1981年WHO分型公布后，對某些肺腫瘤已有了更進(jìn)一步的認(rèn)識，肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的概念被重新界定。肺的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤是一種獨(dú)特的亞型，它擁有某些形態(tài)學(xué)、超微結(jié)構(gòu)和分子學(xué)特征。在組織病理學(xué)上能識別的類型有：小細(xì)胞肺癌、大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌、不典型類癌和類癌。在WHO新分類中將它們統(tǒng)稱為具有神經(jīng)內(nèi)分泌形態(tài)的肺腫瘤。然而，這些腫瘤各有不同的流行病學(xué)、發(fā)生學(xué)、組織形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)特性及臨床預(yù)后[5]。小細(xì)胞肺癌是這類肺癌中最具臨床特點(diǎn)的，其生物學(xué)特性和對化療的反應(yīng)性與大多數(shù)無神經(jīng)內(nèi)分泌分化的肺癌有明顯區(qū)別。從分子生物學(xué)的角度看，p53的突變率和/或突變型p53蛋白在小細(xì)胞肺癌和大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌中的表達(dá)率為50%-80%，在典型類癌中不表達(dá)，在不典型類癌中僅有10%-20%；在3p、13q14、9p和5q22的雜合子丟失頻率，從不典型類癌到大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌和小細(xì)胞肺癌也是逐級增加，所以，這種神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤分類具有臨床預(yù)后意義[6]。

近年來研究[7]發(fā)現(xiàn)一部分NSCLC中也具有ND特征，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)生率在10%-30%。約10%-20%的鱗癌、腺癌和大細(xì)胞癌具有神經(jīng)內(nèi)分泌分化的特性，在腺癌中最常見，其陽性率與使用的標(biāo)志物和檢測技術(shù)密切相關(guān)，這一問題已引起很大的關(guān)注。與缺乏ND的NSCLC相比，這類肺癌患者對化放療的敏感性和預(yù)后研究的尚不深入，對其生物學(xué)行為研究的也較少，故WHO并沒有將其歸入肺癌的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤內(nèi)，而是在1999年“肺與胸膜腫瘤組織病理學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)”中，新增加了非小細(xì)胞肺癌伴神經(jīng)內(nèi)分泌分化（non-small cell lung carcinomas with neuroendocrine differentiation, NSCLC-ND）的概念。NSCLC-ND是指在光鏡下不具有神經(jīng)內(nèi)分泌形態(tài)特征，但免疫組化和電鏡證明有ND的NSCLC。目前免疫組化標(biāo)記是檢測ND較好的方法[8]。

3 肺ND特異性標(biāo)記物

目前公認(rèn)的ND特異性標(biāo)記物是嗜鉻蛋白A（chromogranin A, CgA）和突觸素（synaptophysin, SYN）。嗜鉻蛋白是一組相對分子質(zhì)量大小不等的酸性可溶性蛋白質(zhì)，構(gòu)成特異性致密核心顆粒的基質(zhì)，可伴隨ND多肽激素出細(xì)胞。CgA是其中之一，它是一種酸性可溶性蛋白，屬于調(diào)節(jié)分泌蛋白家族，由439個氨基酸組成，其編碼基因位于14號染色體。主要儲存在腎上腺髓質(zhì)和多種神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的致密核心顆粒中。有研究顯示CgA的表達(dá)與致密核心顆粒出現(xiàn)具有一致性。CgA與各種神經(jīng)肽和胺類內(nèi)分泌顆粒及其它神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物共存，是目前國際公認(rèn)的特異性較強(qiáng)的神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)記物[9]。

相對于CgA來說，SYN的研究更全面。SYN是相對分子質(zhì)量為3.8×104的結(jié)合膜糖蛋白。已發(fā)現(xiàn)哺乳類神經(jīng)系統(tǒng)突觸囊泡膜蛋白至少有15種之多。分子生物學(xué)研究揭示這些蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、分布和功能各不相同。目前，研究的最完善的是突觸素。Wiedenmann等[10]在大鼠、小鼠、牛和人腦突觸囊泡膜上識別了又一新的分子量為38,000 Da的必需膜蛋白，并命名它為Synaptophysin。Navone等[11]詳細(xì)探討和定量研究了p38在大鼠神經(jīng)組織和非神經(jīng)組織的分布和亞細(xì)胞定位。Südhof等[12]采用重組DNA生化技術(shù)闡明了p38的分子特征及其基本結(jié)構(gòu)，暗示此蛋白可能構(gòu)成突觸囊泡特異的膜通道。不久Thomas等[13]對p38的四級結(jié)構(gòu)及功能特性進(jìn)行了研究，證實(shí)p38與通道蛋白具有同樣的結(jié)構(gòu)特征，表明其在神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程中起重要作用。鑒于p38的分子結(jié)構(gòu)和氨基酸序列的確證，p38的免疫細(xì)胞化學(xué)及原位雜交技術(shù)已廣泛用于動物實(shí)驗(yàn)研究，且有部分用于人類，用來檢測p38的分布以及評估突觸數(shù)量和突觸前終末密度，在臨床方面有潛在應(yīng)用價值，如神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的診斷，腫瘤發(fā)生來源及疾病機(jī)制的探討。突觸素存在于腦、脊髓、視網(wǎng)膜中神經(jīng)元的前突觸囊中，還有腎上腺髓質(zhì)中相似的囊腔中以及神經(jīng)肌接頭處。突觸素因此成為前突觸囊膜的分子標(biāo)志物，并且在突觸囊腔的形成以及胞吐過程中起作用。突觸素SYN抗體可以標(biāo)記存在腎上腺髓質(zhì)頸動脈小體、皮膚、垂體、甲狀腺、肺、胰腺、胃腸道粘膜、中樞神經(jīng)、脊髓神經(jīng)以及視網(wǎng)膜中的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞。該抗體可以和多種神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤反應(yīng)，如神經(jīng)母細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、嗜鉻細(xì)胞瘤、非嗜鉻性神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤，還可以和上皮性的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤發(fā)生反應(yīng)，如呼吸道和胃腸道的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤。

以往的實(shí)驗(yàn)有用NSE、NCAM、TNF受體，ProGPR，LEU-7等作為標(biāo)記物來檢測NSCLC的ND[14]，但其敏感性和特異性都不如CgA和SYN在NSCLC中高[15]，NSE標(biāo)記物現(xiàn)在被認(rèn)為是無幫助的，因?yàn)樵贜SCLC中，2/3 NSE染色陽性，特異性較差。檢測ND的方法很多，如電鏡、免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry, IHC）測定ND相關(guān)的酶和原位雜交檢測編碼ND標(biāo)志物的mRNA等，Slodkowska等[16]研究認(rèn)為免疫組化是目前測定ND的標(biāo)準(zhǔn)方法，因?yàn)槊庖呓M化在鑒定神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤上無論從形態(tài)學(xué)或從診斷到以后的治療，在病理上都是無可取代的方法。

國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)CgA陽性表達(dá)率為10%-30%，SYN陽性率為15%-39%。Sundaresan等[17]認(rèn)為腺癌伴有ND的發(fā)生率高于鱗癌，低分化癌的ND高于高分化，CgA和SYN一般在腺癌中表達(dá)較多， CgA在不同分化程度的腫瘤中表達(dá)較接近，而SYN在低分化癌中表達(dá)顯著，說明腫瘤分化程度越低，越容易形成ND，產(chǎn)生異質(zhì)性肺癌細(xì)胞。

4 NSCLC-ND對患者生存期的影響

對肺癌術(shù)后生存情況的預(yù)測，目前較明確的依據(jù)是腫瘤的生物學(xué)特性[18]。越來越多的學(xué)者致力于對肺癌伴神經(jīng)內(nèi)分泌分化現(xiàn)象的研究，分析它們與肺癌惡性程度的關(guān)系，以指導(dǎo)對肺癌預(yù)后的治療[19,20]。NSCLC-ND對預(yù)后的影響在國外一直有爭議。Pelosi等[21]對220例I期的NSCLC研究發(fā)現(xiàn)，ND超過腫瘤細(xì)胞5%的患者預(yù)后較差，I期NSCLC伴ND患者生存期較無ND的NSCLC低，且有明顯差異。他們在220例I期NSCLC患者中，用光鏡和IHC檢測CgA、Syn和呼吸道相關(guān)激素，其中28例為NSCLC伴ND，包括5例腺癌和13例鱗癌患者。5年的隨訪所獲結(jié)論為NSCLC伴ND特別是病理為腺癌且超過5%腫瘤細(xì)胞有ND特性的患者，其生存期比普通的NSCLC患者短（P=0.017），預(yù)后差。而Howe等[22]對439例NSCLC患者的研究提示無論采用手術(shù)還是化療的NSCLC患者，他們的生存期與神經(jīng)內(nèi)分泌分化無關(guān)，因此Howe認(rèn)為不能用現(xiàn)有的檢測ND的免疫化學(xué)指標(biāo)（包括CgA、Syn和NCAM）對NSCLC疾病進(jìn)行預(yù)后評價。Nisman等[23]研究了67例晚期NSCLC發(fā)現(xiàn)治療前CgA高表達(dá)不利于生存。ND是影響生存期的獨(dú)立因素。Graziano等[24]檢測了260例手術(shù)切除的I期、II期NSCLC患者的NSE、CgA、Leu-7和Syn等標(biāo)志物，結(jié)果顯示NSE的陽性率為70%，CgA為14%，Leu-7為8%和Syn為11% ，其中61例患者有2個或2個以上ND標(biāo)志物陽性。1個ND標(biāo)志物陽性與2個或2個以上ND標(biāo)志物陽性患者相比無病生存期無差異。這幾項(xiàng)研究結(jié)果的不一致，可能由于各研究中化療方案有差異，另一方面研究的NSCLC臨床分期也不一致，肺癌細(xì)胞在早晚期的異質(zhì)性差異也有可能使得研究結(jié)果有所差異。由于可能存在其它影響生存期的混雜因素，Gonzalez等[25]把病例限制在Ia期和Ib期的鱗癌和腺癌手術(shù)患者中，避免了亞型的混雜因素的干擾，主要研究SYN的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SYN陽性表達(dá)的患者腫瘤更具侵襲性，預(yù)后更差。Ionescu等[26]研究了更多的肺癌標(biāo)本，得出的結(jié)果卻是ND不能作為預(yù)后的判斷指標(biāo)，由于其文章中未列出肺癌的分期情況，其病例中還包括癌肉瘤和巨細(xì)胞癌，其結(jié)果還待多中心臨床試驗(yàn)來明確。Gregorc等[27]使用ELISA和IHC的方法來檢測CgA和TNF在晚期NSCLC患者血中的濃度和蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)血清CgA和腫瘤組織中的CgA均能作為預(yù)后的預(yù)測因子。CgA血清濃度越高和蛋白表達(dá)陽性率越高，NSCLC患者預(yù)后越差。雖然以上幾項(xiàng)研究的結(jié)果不全一致，但綜合幾項(xiàng)研究的結(jié)果，ND還是對NSCLC患者的生存期有著一定的影響。

5 影響ND的基因

目前對ND現(xiàn)象的研究大多停留在蛋白的水平，關(guān)于ND相關(guān)基因以及這些基因在ND中作用機(jī)制的研究甚少。Kazanjian等[28]報道hASH1與肺癌中的ND存在一定的關(guān)系。研究顯示hASH1在調(diào)節(jié)肺癌ND中具有獨(dú)立性作用，體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，hASH1在神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞和發(fā)生ND的細(xì)胞中呈陽性表達(dá)，此外還發(fā)現(xiàn)hASH1在具有ND的肺癌中呈特異性表達(dá)，并在調(diào)節(jié)肺癌ND中也具有很重要的作用，這些均說明hASH1與肺癌ND具有相關(guān)性。Jiang等[29]研究hASH1在胚胎早期的神經(jīng)和肺的發(fā)育中呈短暫性表達(dá)，但是當(dāng)這些細(xì)胞分化成熟、神經(jīng)表型出現(xiàn)后hASH1的表達(dá)立即消失，并發(fā)現(xiàn)hASH1的表達(dá)與組織分化的程度相關(guān)，并廣泛存在于低分化的腺癌組織中，這些均表明，hASH1在腺癌組織的ND中具有重要的作用。Osada等[30]認(rèn)為雖然hASH1在肺癌的ND起著重要作用，但進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其功能不過是作為一個轉(zhuǎn)錄因子來激活ND，這個蛋白通過ASH1介導(dǎo)脫去乙酰基來抑制DDK1、DKK3和負(fù)調(diào)節(jié)Wnt/beta-catenin和E-cadherin的信號傳導(dǎo)。

Mountzios等[31]認(rèn)為腫瘤抑制基因TP53和RB1的點(diǎn)突變和ND有關(guān)，雖然這種突變在各種肺癌的病理組織都可見，但是其突變的頻率和發(fā)生的“時機(jī)”在NSCLC和有ND的小細(xì)胞肺癌中明顯不同。 D'Alessandro等[32]分析了20個新鮮的肺部的腫瘤組織，認(rèn)為n-ELAV也稱為Hu抗原，其基因的改變和肺部腫瘤的ND的開始以及后續(xù)的一系列侵襲變化密切相關(guān)。

6 展望

惡性腫瘤細(xì)胞朝神經(jīng)內(nèi)分泌方向的分化是腫瘤細(xì)胞在侵襲演進(jìn)過程中的一種分化，還是腫瘤組織本身所具有的一種非特異性的變化，值得我們繼續(xù)探討。ND發(fā)生可能涉及到眾多調(diào)控環(huán)節(jié)，但具體的調(diào)控位點(diǎn)仍然是未知，因此對惡性腫瘤伴ND發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究有重要的理論價值。在NSCLC中進(jìn)一步研究ND現(xiàn)象，對于其生物學(xué)特性和亞型的研究，尋求預(yù)防惡性腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移、防止腫瘤細(xì)胞抗藥性及研制誘導(dǎo)分化的新的治療方法及藥物，都有著重要意義。