張 茜，金若敏

(上海中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全評價研究中心，上海 201203)

在藥理學(xué)和毒理學(xué)實(shí)驗中，最常用的方法有兩種，整體動物在體實(shí)驗和體外實(shí)驗，其中體外實(shí)驗包括對動物離體器官、離體組織、細(xì)胞和病原體的實(shí)驗等［1］。

采用細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗時涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，細(xì)胞培養(yǎng)是將細(xì)胞置于體外條件下進(jìn)行生長和繁殖，由于培養(yǎng)物是單個細(xì)胞或細(xì)胞群，所以在培養(yǎng)的過程中細(xì)胞不再形成組織(動物)。細(xì)胞實(shí)驗具有可直接觀察活細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生命活動、直接觀察細(xì)胞的變化、易于提供大量生物性狀相似的實(shí)驗對象以及耗資少等優(yōu)點(diǎn)。雖然過程中細(xì)胞獨(dú)立生存于人工模擬的體內(nèi)環(huán)境，但該環(huán)境與真實(shí)的體內(nèi)環(huán)境相比仍有很大差異，因而細(xì)胞實(shí)驗結(jié)果不能完全等同于在體實(shí)驗結(jié)果。為了能夠建立更類似于體內(nèi)環(huán)境的培養(yǎng)體系，盡可能使體外環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境相吻合，從而使細(xì)胞間能相互溝通信息，相互支撐生長增殖［2］，20世紀(jì)80年代后期，人們在細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展出了細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)。細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)是將2種或2種以上的細(xì)胞共同培養(yǎng)于同一環(huán)境中的技術(shù)，由于其具有更好地反映體內(nèi)環(huán)境的優(yōu)點(diǎn)，所以這種方法被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代細(xì)胞研究中。本文就細(xì)胞共培養(yǎng)的方法及其在離體實(shí)驗中的作用作一綜述。

1 細(xì)胞共培養(yǎng)的方法

目前，細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)最多應(yīng)用于骨細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞。細(xì)胞共培養(yǎng)體系主要通過兩種方法建立:① 直接共培養(yǎng)體系，即將2種或2種以上的細(xì)胞同時或分別接種于同一孔中，不同種類的細(xì)胞之間直接接觸，例如朱強(qiáng)等［3］將大鼠肝細(xì)胞與Kupffer細(xì)胞按6∶1直接接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，觀察不同情況下肝細(xì)胞生存時間和形態(tài);于聰慧等［4］在研究肝細(xì)胞、胰島細(xì)胞與儲脂細(xì)胞共培養(yǎng)對肝細(xì)胞功能的影響時，先將儲脂細(xì)胞加入培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)條件及培養(yǎng)液同肝細(xì)胞，培養(yǎng)48h后將培養(yǎng)液棄去，再加入肝細(xì)胞和胰島細(xì)胞，3種細(xì)胞的培養(yǎng)比例為4000∶200∶1;王金晶等［5］將肝竇血管內(nèi)皮細(xì)胞種植在包被膠原的24孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞鋪展成片后，將一部分肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞植于其上的共培養(yǎng)體系。②間接共培養(yǎng)體系，即將2種或2種以上的細(xì)胞分別接種于不同的載體上，然后將這兩種載體置于同一培養(yǎng)環(huán)境之中，使不同種類的細(xì)胞共用同一種培養(yǎng)體系而不直接接觸，例如高毅等［6］將分別接種于蓋玻片上的人骨髓來源多能成體祖細(xì)胞在與人肝細(xì)胞系L-O2細(xì)胞，按照各1∶1共置于培養(yǎng)皿中，來觀察培養(yǎng)液共通時肝細(xì)胞特征性表型表達(dá)的變化情況;盧曉露等［7］利用transwell小室(又稱Millicell插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿)，將腎小管上皮細(xì)胞接種于6孔共培養(yǎng)板的上室濾膜上，加入藥物，同時將腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞接種于另一6孔共培養(yǎng)板的下室進(jìn)行培養(yǎng)，一段時間后放入經(jīng)藥物刺激的上室，將2種細(xì)胞共培養(yǎng);方靜等［8］將腎小管上皮細(xì)胞接種于預(yù)先放入了蓋玻片的24孔板中，培養(yǎng)一定時間，同時將成纖維細(xì)胞種入24孔板中，培養(yǎng)一段時間后放入不銹鋼篩網(wǎng)支架，再放入種有腎小管上皮細(xì)胞的蓋玻片。

2 共培養(yǎng)體系在離體實(shí)驗中的作用

2.1 誘導(dǎo)細(xì)胞向另一種細(xì)胞分化

在細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，輔助細(xì)胞可以誘導(dǎo)目的細(xì)胞向輔助細(xì)胞或向另一種細(xì)胞分化。韓翠萍等［9］將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與肝細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，同時采用流式細(xì)胞儀檢測貼壁干細(xì)胞的表面標(biāo)志，倒置相差顯微鏡觀察共培養(yǎng)后細(xì)胞形態(tài)的變化，RT-PCR法檢測肝細(xì)胞表面抗原mRNA的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著共培養(yǎng)時間的延長，越來越多的干細(xì)胞從長梭形變?yōu)榕c肝細(xì)胞形態(tài)相似的多角形，并且細(xì)胞角蛋白19 mRNA和白蛋白mRNA開始表達(dá)，甲胎蛋白mRNA表達(dá)減弱。高大寬等［10］用脂肪干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞共培養(yǎng)，8～12 d后發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)組出現(xiàn)大量成熟神經(jīng)元，神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元的百分率約為21%，與對照組分化率僅有4%相比有顯著差異，表明脂肪干細(xì)胞在體外能夠促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元轉(zhuǎn)化。高毅等［6］將人骨髓來源多能成體祖細(xì)胞在與人肝細(xì)胞系L-O2細(xì)胞間接共同培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，人肝細(xì)胞系L-O2能夠誘導(dǎo)人骨髓來源的MAPCs向成熟肝樣細(xì)胞定向分化。

2.2 誘導(dǎo)細(xì)胞自身的分化

共培養(yǎng)體系中的輔助細(xì)胞增強(qiáng)目的細(xì)胞的分化能力。李全修等［11］通過建立骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和髓核細(xì)胞分層共培養(yǎng)模型，觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對髓核細(xì)胞分化的影響。結(jié)果表明，兩種細(xì)胞共同培養(yǎng)后，能使髓核細(xì)胞的分化增殖顯著增加，其特征性物質(zhì)表達(dá)升高。解杰等［12］利用藻酸鹽模擬骨髓微環(huán)境，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與前列腺癌細(xì)胞在藻酸鈣中混合培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，有干細(xì)胞存在共培養(yǎng)的三維藻酸鈣微環(huán)境中，前列腺癌細(xì)胞的成簇速度、數(shù)量及成瘤率均升高，提示在藻酸鈣微球環(huán)境中，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞有利于前列腺癌細(xì)胞增殖及成簇性發(fā)展;朱彤等［13］在研究共培養(yǎng)系統(tǒng)中巨噬細(xì)胞對大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活和軸突再生的影響后發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞可明顯促進(jìn)共培養(yǎng)體系中視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突的生長。

2.3 維持細(xì)胞的功能和活力

共培養(yǎng)體系中的輔助細(xì)胞可以維持目的細(xì)胞的基本功能。肝細(xì)胞實(shí)驗主要用于藥效實(shí)驗、毒性實(shí)驗和建立生物人工肝臟，其中在建立生物人工肝時只要給予適當(dāng)?shù)拇碳ぞ湍苁垢渭?xì)胞快速增長，最后成為肝組織，但是在此過程中最為重要的是要使生成的肝組織在很長一段時間都能夠維持其功能不變，而肝細(xì)胞本身具有的短期存活率和高速分化的特點(diǎn)使得人工肝的構(gòu)建困難重重，但是Bhandari等［14］采用共培養(yǎng)技術(shù)，將3T3成纖維細(xì)胞與原代的大鼠肝細(xì)胞共培養(yǎng)，18 d后，單獨(dú)培養(yǎng)的原代大鼠肝細(xì)胞活力大大降低，喪失了分泌白蛋白和乙氧基-9-羥基異吩噁唑酮-鄰-去乙基酶的能力，而共培養(yǎng)組中肝細(xì)胞活力保持不變，表現(xiàn)出良好的分泌功能，從而證實(shí)了擁有的3T3成纖維細(xì)胞的共同培養(yǎng)體系能夠很好地保存肝細(xì)胞的活力和功能。于聰慧等［4］在研究肝細(xì)胞、胰島細(xì)胞與儲脂細(xì)胞共培養(yǎng)對肝細(xì)胞功能的影響時發(fā)現(xiàn)，這3種細(xì)胞共同培養(yǎng)能明顯延長肝細(xì)胞的存活期。

2.4 調(diào)控細(xì)胞增殖

共培養(yǎng)體系中的輔助細(xì)胞可以調(diào)節(jié)目的細(xì)胞的生長狀態(tài)。王東旭等［15］將大鼠髓間充質(zhì)肝細(xì)胞與肝星狀細(xì)胞共同培養(yǎng)一段時間后發(fā)現(xiàn)，大鼠髓間充質(zhì)肝細(xì)胞能顯著抑制肝星狀細(xì)胞的生長，同時還阻止其從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)化，下調(diào)周期蛋白D1表達(dá)，上調(diào)P27的表達(dá)［15］。

2.5 促進(jìn)早期胚胎的發(fā)育

共培養(yǎng)體系中的輔助細(xì)胞可以提高目的細(xì)胞的發(fā)育。胚胎共培養(yǎng)是指在培養(yǎng)基內(nèi)加入某一種輔助細(xì)胞，如輸卵管上皮細(xì)胞、子宮內(nèi)膜細(xì)胞和卵丘細(xì)胞等與胚胎一起培養(yǎng)，從而更好地滿足胚胎在不同細(xì)胞期對物質(zhì)的需求。采用共培養(yǎng)的方式培養(yǎng)胚胎，建立更類似于體內(nèi)環(huán)境的培養(yǎng)體系，使細(xì)胞間能相互溝通信息，相互支撐生長增殖，使胚胎的體外發(fā)育率得到大大的提高，從而避免早期胚胎的發(fā)育阻滯。有研究顯示［16－18］，用人體子宮內(nèi)膜細(xì)胞與體外受精-胚胎移植胚胎共培養(yǎng)，與在傳統(tǒng)培養(yǎng)液中單獨(dú)培養(yǎng)相比，胚胎細(xì)胞數(shù)顯著增加，胞質(zhì)碎片率明顯下降，培養(yǎng)至囊胚階段的胚胎數(shù)增加，種植率和妊娠率得到了提高。

除此之外，共培養(yǎng)體系促進(jìn)早期胚胎發(fā)育的另一原因是其可代謝降解胚胎發(fā)育過程中產(chǎn)生的銨、次黃嘌呤和氧自由基等有毒物質(zhì)，Tan等［19］研究結(jié)果表明，共培養(yǎng)細(xì)胞能降低培養(yǎng)液中的次黃嘌呤濃度，消除其對胚胎發(fā)育的抑制作用。Joo等［20］通過小鼠的胚胎與人輸卵管細(xì)胞共培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)組的氧自由基濃度比對照組明顯降低。

2.6 提高代謝物產(chǎn)量

共培養(yǎng)體系中的輔助細(xì)胞可以提高目的細(xì)胞產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。長期以來，利用植物細(xì)胞分離多種次級代謝產(chǎn)物的方法因具有不受環(huán)境生態(tài)和氣候條件的限制、增殖速度比單純植物栽培快以及較容易調(diào)控次級代謝產(chǎn)物合成等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注［21］，而近年來，由于細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，通過使用不同物種材料進(jìn)行共培養(yǎng)來提高植物，特別是藥用植物細(xì)胞的培養(yǎng)效率及其次級代謝產(chǎn)物合成的能力成為了一種有廣闊前途的新技術(shù)。王義等［22］研究了人參懸浮細(xì)胞和胡蘿卜懸浮細(xì)胞的共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)提高了人參細(xì)胞合成人參皂苷的能力。方靜等［8］發(fā)現(xiàn)，被馬兜鈴酸誘導(dǎo)活化的腎小管上皮細(xì)胞可能通過分泌“轉(zhuǎn)化生長因子β1”與腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞相互影響，導(dǎo)致其合成細(xì)胞外基質(zhì)增多，故提出這一機(jī)制很可能是慢性馬兜鈴酸腎病腎間質(zhì)纖維化的重要致病途徑之一。

3 前景與展望

由于細(xì)胞間相互的影響對一些如增殖和分化的細(xì)胞特征發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，為了模擬組織之間的相互作用，從而建立了共培養(yǎng)體系，該體系是將多種細(xì)胞置于同一環(huán)境中，如內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，肝細(xì)胞和纖維細(xì)胞以及角膜上皮細(xì)胞和角膜細(xì)胞，用以研究這些細(xì)胞之間復(fù)雜的相互反應(yīng)［23－26］，所以該體系比單一細(xì)胞培養(yǎng)更能夠準(zhǔn)確地反映整體情況。目前細(xì)胞共培養(yǎng)體系主要用于藥效方面的研究，而用于毒理學(xué)方面的研究卻非常少。共培養(yǎng)體系縮短實(shí)驗次數(shù)、減少藥物使用量、辨別藥物的優(yōu)先毒性靶器官以及研究藥物代謝產(chǎn)物的不良作用等優(yōu)點(diǎn)，均符合目前國際上所提倡的“3R原則(減少，替代，優(yōu)化)”，因而可成為未來毒理學(xué)研究發(fā)展的方向之一。

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