杜金玲,牟 巍,趙亞榮,郭書豪,盧會英
(北京大北農(nóng)動物醫(yī)學(xué)研究中心,北京 100097)
鴨疫里氏桿菌病是由鴨疫里氏桿菌(Riemerella anatipestifer,RA)引起的一種接觸性傳染病。多見于1~8周齡雛鴨,尤以2~3周齡雛鴨最易感,死亡率一般在5%~75%,當(dāng)環(huán)境惡劣或混合感染其他疫病時死亡率可達(dá)90%以上,耐過鴨生長不良,失去飼養(yǎng)價值。該病廣泛分布于世界各養(yǎng)鴨國家和地區(qū),不具有季節(jié)性,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,已成為危害養(yǎng)鴨業(yè)最嚴(yán)重的疾病之一[1-3]。RA血清型較多,國際上已報道了21個,程安春等在此基礎(chǔ)上又發(fā)現(xiàn)了4個新的血清型[4],我國目前發(fā)現(xiàn)存在16個血清型。OMPs(Outer Membrane Proteins)是RA的外膜蛋白,具有良好的免疫原性,可同時誘導(dǎo)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫,具有異種血清型的免疫交叉保護(hù)作用,是一種潛在的共同保護(hù)性抗原[5]。同時,OMPs與細(xì)菌毒力密切相關(guān),在診斷及疫苗研制中都具有重要的應(yīng)用價值[6],本文就RA OMPs研究進(jìn)展進(jìn)行簡要綜述,以期為RA致病機(jī)制的研究、新疫苗和診斷試劑的開發(fā)提供一些參考。
1.1 結(jié)構(gòu)保守性 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的RA外膜蛋白A(Outer Membrane Protein A,OMPA)基因序列,魏秀麗等[7]在其高度保守區(qū)設(shè)計(jì)一對特異性引物,分別擴(kuò)增了8株RA中國大陸分離株的OMPA基因并進(jìn)行序列分析,證實(shí)RA OMPA基因均為由1164個堿基組成的ORF,編碼387個氨基酸組成的蛋白質(zhì),起始密碼子均為ATG,終止密碼子均為TAA,其核苷酸序列非常保守,同源性高達(dá)88.2% ~100%,氨基酸同源性達(dá)到 88.9% ~100%。張 煒[8]根 據(jù) NCBI檢 索 所 得 的 RA ATCC11845株的2個OMPA序列用軟件DNA Star分析后發(fā)現(xiàn),2個OMPA均由1164個堿基組成,其中N端630個堿基完全相同,C端533個堿基存在多處不同,推測這630 bp為RA不同血清型的共有序列,并按此序列設(shè)計(jì)一對引物,用RA1型北京參考株擴(kuò)增,產(chǎn)物測序結(jié)果與預(yù)期一致。
同所有革蘭氏陰性菌的OMPA結(jié)構(gòu)相似,RA的OMPA基因也包含1個C-端保守區(qū)以及1個可變的N-端,編碼外膜蛋白的基因存在于RA標(biāo)準(zhǔn)株和所有血清型參照株中。Bin Huang[9]等完整表達(dá)了RA ATCC11845株的OMPA基因,15株臺灣RA分離株、8株參考血清型菌株和國外OMPA序列差異度范圍為0~10.5%。其原因極有可能是不同血清型OMPA基因C端及閱讀框外側(cè)序列差異較大。外膜蛋白只有胞外區(qū)才能刺激產(chǎn)生抗體,膜內(nèi)區(qū)序列不必考慮。
與其他細(xì)菌有所不同,RA的OMPA具有6個EF-手銬結(jié)合域和2個PEST結(jié)構(gòu)域,這些基序(motif)的出現(xiàn)表明它們在外膜蛋白毒力方面有重要作用,而且編碼外膜蛋白的基因存在于RA標(biāo)準(zhǔn)株和所有血清型參照株中。盡管各血清型RA之間存在一定的遺傳性差異,但這并不影響外膜蛋白的強(qiáng)抗原特性[10]。由于其氨基酸序列較保守,各血清型間差異較小,所以認(rèn)為外膜蛋白在RA感染的血清學(xué)檢測中很有意義,而且在亞單位疫苗的研制中也具潛在的應(yīng)用價值[11]。
1.2 毒力 外膜蛋白是革蘭氏陰性菌外膜的主要結(jié)構(gòu),占其全部組成的1/2,除在維持外膜結(jié)構(gòu)、保證物質(zhì)運(yùn)輸?shù)确矫婢哂兄匾饔?,還與細(xì)菌毒力密切相關(guān)[12-15]。劉燕等[16]首次應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)雙向電泳技術(shù),對血清2型RA(RA2)強(qiáng)毒株及其體外傳200代(RA200)獲得的弱毒菌株的外膜蛋白進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究。質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn),RA2及RA200外膜蛋白表達(dá)存在差異,差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)達(dá)到5倍以上的有3個蛋白,其中1個為熱休克蛋白Hsp20家族成員,該蛋白質(zhì)的改變會導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)構(gòu)象的改變,進(jìn)一步會導(dǎo)致細(xì)菌的某些生物學(xué)特性發(fā)生改變;另外2個蛋白為轉(zhuǎn)座酶(transposase),轉(zhuǎn)座酶是催化轉(zhuǎn)座因子從染色體原來的位置切離下來,插入到染色體新的位置的一種酶,革蘭氏陰性菌的轉(zhuǎn)座子與細(xì)菌的毒力密切相關(guān),強(qiáng)、弱毒株轉(zhuǎn)座酶表達(dá)量差異可能與二者毒力變化密切相關(guān)。
GXRA01(RA血清1型)和GXRA07(RA血清2型)株菌毒力存在差異,前者的致病性高于后者。潘艷等[17]應(yīng)用雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)對上述2株菌體蛋白進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究,分析2株RA菌體蛋白表達(dá)特點(diǎn),結(jié)果經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定出17個蛋白點(diǎn)中有7個為OMPA,推測這些差異表達(dá)蛋白與血清分型及毒力的不同密切相關(guān)。
1.3 免疫原性 外膜蛋白在革蘭氏陰性菌引起易感動物發(fā)病的過程中起著重要的作用。很多細(xì)菌的外膜蛋白具有免疫原性且能誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)已得到證實(shí)[18-21]。RA OMPA 基因結(jié)構(gòu)的保守性同樣促使人們以極大的興趣研究其免疫學(xué)功能,以期解決RA交叉保護(hù)的問題,為進(jìn)一步篩選治療藥物提供新的平臺[22-23]。
通過提取RA的OMPA、Western Blot檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)外膜蛋白與免疫鴨血清和自然感染后康復(fù)鴨血清出現(xiàn)較強(qiáng)的陽性反應(yīng),而與感染發(fā)病的瀕死鴨血清反應(yīng)較弱,表明外膜蛋白可能是RA的免疫原性蛋白之一。經(jīng)甲醛滅活RA1外膜蛋白的菌苗能很好地抵抗同源菌的攻擊,100℃處理1 h或用胰蛋白酶處理后完全喪失免疫原性,經(jīng)脂酶處理后喪失部分免疫原性,證明了外膜蛋白對于抵抗RA感染有一定的保護(hù)作用,是RA的主要免疫原[24-25]。用超速離心法提取5種血清型的RA外膜蛋白,采用SDS-PAGE技術(shù)對其電泳圖譜進(jìn)行比較分析,并采用免疫印跡技術(shù)對其免疫原性及是否存在交叉免疫原性進(jìn)行初步研究,結(jié)果表明其外膜蛋白的電泳圖譜具有一定相似性,對主要外膜蛋白條帶的組成進(jìn)行分析后可將這5種血清型的RA外膜蛋白分為3個外膜蛋白型,同時也表明不同血清型的菌株之間存在相同的外膜蛋白型。使用抗RA外膜蛋白陽性鴨血清、抗RA陽性鴨血清和抗RA陽性雞血清對RA外膜蛋白抗原進(jìn)行免疫印跡檢測,表明5種血清型的RA外膜蛋白均有免疫原性[26]。劉燕等分析了1型、2型、10型與11型四種血清型RA外膜蛋白的電泳圖譜,發(fā)現(xiàn)相同血清型的電泳圖譜相似,不同血清型的電泳圖譜差異較大。RA外膜蛋白抗原在不同血清型菌株暴露的程度有所不同,只有位于外膜外部的表位,才可能在細(xì)菌體內(nèi)生長,并刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的免疫反應(yīng)或保護(hù)性抗體,所以1型、2型、10型與11型RA外膜蛋白與各自同型的抗血清反應(yīng)后均出現(xiàn)了多條陽性反應(yīng)帶,免疫原性較強(qiáng)的外膜蛋白顯示的條帶較強(qiáng),免疫原性稍差的反應(yīng)條帶較弱。但不同血清型的電泳圖譜雖存在差異,卻仍有相似[27],試驗(yàn)中四種血清型在44、69 KDa處有交叉反應(yīng)的蛋白多肽,此蛋白多肽可能為具有交叉保護(hù)作用的免疫原。
外膜蛋白的免疫原性作用在多種細(xì)菌中已被確證,而且某些細(xì)菌的外膜蛋白已被應(yīng)用于試制疫苗,其中部分編碼外膜蛋白基因已被克隆并進(jìn)行重組表達(dá)。Subramaniam等[10]報道了RA15型基因組文庫的構(gòu)建,從中篩選出了具有免疫原性的42 ku的OMPA,并且在大腸桿菌中克隆和表達(dá)了此種外膜蛋白?;舸涿罚?8]等參照已知的全基因序列設(shè)計(jì)特異性引物克隆RA OMPA并進(jìn)行表達(dá),經(jīng)測序比較,與標(biāo)準(zhǔn)序列的核苷酸同源性達(dá)99.8%,Western Blot檢測 RA1、RA2、RA10、RA11 型全菌兔血清呈陽性,而陰性兔血清不反應(yīng),說明表達(dá)蛋白具有很強(qiáng)的免疫反應(yīng)特異性,并具有種的特異性。
由于RA不同血清型之間基本無交叉保護(hù)性,這一特性為該病的免疫和快速診斷帶來了困難。因此找到該菌不同血清型的共同抗原,并以此抗原為基礎(chǔ)建立血清學(xué)檢測方法,使得快速鑒定RA的感染成為可能,是當(dāng)前RA研究的重要方向。
OMPA是RA各血清型所共有的蛋白,并且已經(jīng)證實(shí)該蛋白在各地各型菌株中具有保守性,因此利用PCR方法檢測OMPA部分基因,可以作為該菌鑒定的一種方法。胡清海等[29]根據(jù)已發(fā)表的RA15型CVL110/89株編碼42 KDa主要外膜蛋白的基因序列設(shè)計(jì)引物,建立PCR方法,對7個血清型的RA純培養(yǎng)菌及野外病死鴨病料組織進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)7個血清型的RA純培養(yǎng)菌DNA均可擴(kuò)增出809 bp的DNA片段,而對照的大腸桿菌和沙門氏菌純培養(yǎng)菌DNA擴(kuò)增結(jié)果為陰性,由此表明,針對OMPA建立的PCR方法可用于RA的鑒定和快速診斷(取腦組織)。程龍飛[30]等應(yīng)用該法對42株RA進(jìn)行了檢測,全部可以擴(kuò)增出特異性條帶,且在優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn)最低檢出量為1 pg,證明該方法不僅敏感,而且適用于多種不同RA菌株的鑒定。楊建遠(yuǎn)等[31]根據(jù) GenBank中 25株 RA的OMPA基因序列,在其高度保守區(qū)設(shè)計(jì)了一對特異性引物,也成功地建立了RA快速PCR檢測方法。
RA的OMPA結(jié)構(gòu)高度保守,且具有很強(qiáng)的免疫原性,能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體。這一特性也被用于研制單克隆抗體進(jìn)行診斷。覃志初[32]等首次嘗試了RA外膜蛋白McAb的研制,采用高速離心、超聲裂解和化學(xué)試劑作用的方法提取RA外膜蛋白,濃度可達(dá)10 μg/mL,作為間接ELISA的包被抗原,用于檢測RA單抗以及融合前的加強(qiáng)免疫,該研究同時建立了相應(yīng)的篩選體系,為外膜蛋白免疫原性蛋白質(zhì)及診斷抗原等相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。
霍翠梅[28]等用表達(dá)純化的RA OMPA作為包被抗原,建立了檢測鴨疫里默氏桿菌的間接ELISA方法。實(shí)驗(yàn)表明,該法特異性好、重復(fù)性高,相比以往以破碎的菌體進(jìn)行包被只能檢測一種血清型的抗體,以O(shè)MPA作為包被抗原可以檢測多種血清型抗體,而且提高了檢測效率。
外膜蛋白廣泛存在于革蘭氏陰性菌群中,作為細(xì)菌的免疫原蛋白之一,它能在無免疫佐劑輔助的情況下誘導(dǎo)特異性的體液和細(xì)胞毒性反應(yīng),而且還能輔助其他抗原內(nèi)化和交叉提呈,具有潛在的免疫載體功能,可以提高機(jī)體的免疫應(yīng)答,具有較強(qiáng)的免疫保護(hù)作用,已廣泛用于疫苗的研究和開發(fā)[33]。由于各血清型交叉保護(hù)力差,應(yīng)用單一菌株滅活苗保護(hù)作用有限,鑒于OMPA在不同血清型中均具有良好的免疫原性,可制成一種針對多血清型的細(xì)菌疫苗,其在制備亞單位疫苗研究中具有良好前景。
蘇敬良等[24]用提取的RA1型外膜蛋白加弗氏佐劑制成疫苗,免疫北京鴨后,可誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的抗體,且抗體維持時間較長。經(jīng)過兩次免疫后,對同源細(xì)菌攻擊的保護(hù)率為100%。程安春等[25]提取RA2型的外膜蛋白,免疫印跡證實(shí),RA2型的分子質(zhì)量為40000 u的外膜蛋白與免疫鴨血清呈較強(qiáng)的陽性反應(yīng),是主要免疫原蛋白。用分離的外膜蛋白加上弗氏佐劑制備的亞單位疫苗免疫雛鴨后,可誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的抗體,免疫鴨對同源RA的攻擊可產(chǎn)生100%的免疫保護(hù)。Pathanasop Hon等[34]應(yīng)用飽和硫酸銨沉淀法和SepHadex G-200凝膠柱提純了RA1的外膜蛋白,對14日齡雛鴨一次性皮下注射氫氧化鋁吸附的RA蛋白(100 μg/只),免疫后 21 d攻以同源菌(5×109CFU/只),可獲得100%的保護(hù),這為研制和開發(fā)RA蛋白苗奠定了基礎(chǔ)。
幾乎所有RA血清型均只與同源抗血清發(fā)生特異性反應(yīng),不同血清型對異型強(qiáng)毒沒有保護(hù)或保護(hù)力很低,此特點(diǎn)為RA的預(yù)防工作帶來了極大困難。但劉燕等發(fā)現(xiàn)不同血清型的電泳圖譜雖存在差異,但仍有相似[27],這是由于在不同血清型的菌株中存在有交叉反應(yīng)的蛋白多肽,推測其可能為具有交叉保護(hù)作用的免疫原。Bin Huang[9]等對表達(dá)的RA ATCC11845株的OMPA進(jìn)行免疫保護(hù)性實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)其可以與多個血清型RA陽性血清結(jié)合,但其單獨(dú)作為疫苗免疫雛鴨后,卻不能對攻毒提供足夠的免疫保護(hù)力,其原因可能是該蛋白抗原性較弱,使用佐劑可增強(qiáng)其免疫保護(hù)力,其原因有待進(jìn)一步研究。張煒[8]用異于 ATCC11845株和CVL110/89株的RA擴(kuò)增出了與前兩者完全相同的序列,而且該擴(kuò)增序列與質(zhì)粒連接、轉(zhuǎn)化并表達(dá)的蛋白,也具有與多種血清型RA陽性血清結(jié)合的能力,與Bin Huang等的結(jié)果相符。這也證明了以O(shè)MPA為基礎(chǔ)研制一種RA疫苗來同時保護(hù)雛鴨免受多種血清型RA感染的策略具有可行性。
RA病給養(yǎng)鴨業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,引起越來越多的關(guān)注。各血清型之間缺乏交叉免疫,而OMPs作為不同血清型的共同免疫蛋白,可能與RA的毒力存在一定的關(guān)系,深入研究將有助于揭示細(xì)菌的致病機(jī)制,還可用以探索簡便快速特異的診斷方法進(jìn)行菌種鑒定,更有望被制成一種可以針對多RA血清型的疫苗。
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