徐鳳宇，姜秀云，么乃全，錢愛(ài)東

2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130118；

3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118

副結(jié)核病是由禽分枝桿菌副結(jié)核亞種（Mycobacteriumaviumsubsp.Paratuberculosis，MAP）引起的多種動(dòng)物共患的慢性、腸道肉芽腫性傳染病，也稱Johne＇s病，呈世界性分布，在我國(guó)被列入二類動(dòng)物疫病。調(diào)查表明，美國(guó)大約20%～40%的奶牛群感染MAP，常導(dǎo)致產(chǎn)奶量下降及體重減輕，每頭感染牛每年的損失約＄227［1］。由于目前針對(duì)該病的疫苗存在干擾檢疫等缺點(diǎn)，所以根除的最好辦法是盡早檢出、隔離或淘汰病畜。該病原的檢測(cè)方法有多種，如直接鏡檢、分離培養(yǎng)、分子生物學(xué)檢測(cè)、噬菌體生物擴(kuò)增技術(shù)等［2］，但這些方法或敏感性不高，或耗時(shí)長(zhǎng)，且在疾病的亞臨床階段揭發(fā)率較低，而恰恰該病的亞臨床期較長(zhǎng)，所以降低了以上方法在臨床診斷中的應(yīng)用價(jià)值。血清學(xué)方法和遲發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)可快速、有效地診斷該病，有些方法能檢出亞臨床病例［3］，但目前這些以抗原為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法所用抗原多為復(fù)合物，與其它分枝桿菌存在交叉反應(yīng)，而環(huán)境中的腐生分枝桿菌等又常侵襲動(dòng)物，所以使用復(fù)合抗原檢測(cè)的特異性不高，限制了其在臨床檢測(cè)中的應(yīng)用。所以，近年很多研究與優(yōu)化診斷抗原相關(guān)，隨著該病原基因組全序列的揭曉，這項(xiàng)工作的進(jìn)程也在加快，特綜述之。

1 復(fù)合抗原

為提高副結(jié)核病診斷的特異性，有學(xué)者對(duì)MAP的蛋白組分進(jìn)行了研究。Cho等［4］比較了該菌產(chǎn)生的培養(yǎng)濾液（culture filtrates，CF）和細(xì)胞提取液（cellular extracts，CE）的蛋白質(zhì)組，研究了二者的抗原性，發(fā)現(xiàn)CE蛋白分子量范圍較寬，有的蛋白達(dá)100 ku，而多數(shù)CF蛋白分子量小于50 ku；二維電泳結(jié)果表明：CF蛋白的等電點(diǎn)（pI值）很窄，多為p H 4.0～5.5，CE蛋白的pI值為p H 4.0～7.0；用MAP自然感染的牛血清進(jìn)行免疫印跡分析，與血清發(fā)生反應(yīng)的CF蛋白較多，暗示進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)時(shí)，可用CF代替CE；但即使是以CF蛋白為抗原，也不能檢測(cè)所有的MAP陽(yáng)性牛，尤其是在感染早期未產(chǎn)生足夠的抗體應(yīng)答時(shí)。在此基礎(chǔ)上，該課題組以MAP JTC303株CF蛋白為抗原，將待檢牛血清、牛奶用草分枝桿菌的細(xì)胞提取物吸收去除其中的交叉抗體，建立了JTC－ELISA方法，與5個(gè)商業(yè)ELISA試劑盒相比，診斷的敏感性明顯提高，特異性也很穩(wěn)定，尤其在糞排菌率較低的病例中應(yīng)用效果更好，敏感性為40%，而商業(yè)試劑盒的敏感性為20%［5］。我國(guó)何昭陽(yáng)等［6］采用除去草分枝桿菌抗原或其類屬抗原的辦法，制備了親和層析抗原和草柱親和抗原，建立的ELISA檢測(cè)方法表現(xiàn)出了良好的特異性，其中草柱親和抗原制備更容易，收獲量多，有利于大批量生產(chǎn)應(yīng)用，將其應(yīng)用于臨床中效果非常好，尤其適用于消除PPD－ELISA產(chǎn)生的假陽(yáng)性反應(yīng)。

2 特異抗原

2.1 細(xì)胞免疫診斷抗原

2.1.1 Ag85復(fù)合物 作為分枝酰轉(zhuǎn)移酶家族，Ag85復(fù)合物存在于MAP培養(yǎng)濾液中，大小約30～32 ku。一方面，它是MAP、牛分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌等的保護(hù)性抗原，亞單位疫苗的候選抗原之一；另一方面，它能有效增強(qiáng)MAP感染10周左右的牛產(chǎn)生體外IFN－γ應(yīng)答，其中Ag85A（MAP 0216）和Ag85B（MAP 1609c）合成肽作用強(qiáng)于Ag85C（MAP 3531c）；用實(shí)驗(yàn)感染牛鑒定發(fā)現(xiàn)，Ag85B的T細(xì)胞表位在第145～162個(gè)氨基酸之間；應(yīng)用重組并純化的Ag85A和Ag85B檢測(cè)感染MAP的犢牛會(huì)產(chǎn)生增殖反應(yīng)，作為T細(xì)胞抗原可以早期識(shí)別自然感染牛［7］。

2.1.2 MAP1204和 MAP1087 Bannantine等［1］分析了92個(gè)重組的MAP蛋白（包括Ag85復(fù)合物），發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)可能的抗原很適合作為副結(jié)核病牛的早期（感染后70天）檢測(cè)，這兩個(gè)蛋白分別由MAP1087和MAP1204編碼，大小分別為146、244個(gè)氨基酸，且兩個(gè)蛋白聯(lián)合應(yīng)用能檢測(cè)出更多的亞臨床病牛，為該病的早期診斷提供了思路。

2.1.3 MAP41 2005 年，Nagata 等［8］獲 得 了MAP10、MAP39和MAP41（后兩者為PPE家族成員，分別由MAP3184、MAP1518基因編碼）的核苷酸序列，并用大腸桿菌表達(dá)了此三種蛋白，發(fā)現(xiàn)它們能增強(qiáng)MAP感染牛外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生IFN－γ的能力。一般而言，感染MAP的牛血細(xì)胞在用MAP抗原刺激后會(huì)產(chǎn)生大量IL－10，從而抑制T細(xì)胞產(chǎn)生IFN－γ，可以作為重要的診斷指標(biāo)。2010年，該研究者［9］發(fā)現(xiàn)MAP41可誘導(dǎo)接種MAP兩周后的實(shí)驗(yàn)牛產(chǎn)生IL－10，檢出的時(shí)間早于IFN－γ，產(chǎn)生的量高于其他分枝桿菌感染的牛，在以豚鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物時(shí)也得到了相似的結(jié)果。此研究表明，MAP41檢測(cè)IL－10水平可以作為一種有效的檢測(cè)方法，而且能提前檢出時(shí)間，減少帶菌動(dòng)物排菌污染環(huán)境并對(duì)其他動(dòng)物及人類造成的威脅，有利于更好地控制副結(jié)核病。

2.2 體液免疫診斷抗原

2.2.1 34 ku蛋白 34 ku蛋白的編碼基因是從MAP的λgt11文庫(kù)中篩選到的，該基因包含三部分。最初的研究表明，其編碼的13.6 ku羧基端（a362）與所有檢測(cè)的MAP發(fā)生反應(yīng)而不與其它20株菌包括禽分枝亞種禽亞種（MAA）和胞內(nèi)分枝桿菌發(fā)生反應(yīng)。免疫電鏡觀察發(fā)現(xiàn)在MAP表面存在a362多肽，用重組的a362多肽作ELISA抗原，結(jié)果能對(duì)所有檢測(cè)的感染牛及疾病所有階段的血樣準(zhǔn)確分析，認(rèn)為該蛋白的羧基端含有種特異性表位，曾被用于牛副結(jié)核病的ELISA特異性診斷中。但是，2007年 Malamo等［10］制備了a362的單克隆抗體（MAbs），在ELISA和免疫印跡實(shí)驗(yàn)中，2株單抗均與MAA、胞內(nèi)分枝桿菌發(fā)生交叉反應(yīng)，重組蛋白也與3種分枝桿菌的兔多克隆抗體發(fā)生反應(yīng)，表明該蛋白羧基端有MAP、MAA及胞內(nèi)分枝桿菌共有的抗原決定簇，在自然感染牛體內(nèi)很容易誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生，共有決定簇降低了34 ku蛋白的羧基端用于診斷的特異性。

另外，Willemsen等［11］發(fā)現(xiàn)9、15和34 ku蛋白（分別由MAP2609、MAP2942c和MAP0210c編碼）與結(jié)核桿菌的TB8.4、MPT53和Erp抗原具有很高的同源性，且都能被臨床或亞臨床感染牛的抗體識(shí)別，三者均為分泌抗原，可能被用作診斷抗原。經(jīng)過(guò)氨基酸序列比較，此處的34 ku蛋白與前述的34 ku并非同一物質(zhì)。

2.2.2 35 ku抗原 Zaatari等［12］克隆并表達(dá)了分子量35 ku的抗原（p35 Ag），發(fā)現(xiàn)編碼此蛋白的基因（p35）只與禽分枝桿菌復(fù)合群的DNA雜交。用感染或未感染的57只動(dòng)物參考血清進(jìn)行免疫印跡，發(fā)現(xiàn)它能100%識(shí)別處于臨床期動(dòng)物（12頭牛、2只山羊和2只綿羊）的血清，對(duì)處于亞臨床階段的20頭牛的血清識(shí)別率為75%，而15頭非MAP感染奶牛、3頭BCG接種的牛、3頭人工大劑量接種MAP的奶牛血清不能被p35 Ag識(shí)別。總的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值分別為86%、100%、100%和75%，p35 Ag免疫印跡的準(zhǔn)確率超過(guò)了當(dāng)時(shí)商業(yè)上可用的診斷Johne＇s病的方法，推測(cè)其可用于副結(jié)核病的診斷，其編碼基因可作成探針等用于禽分枝桿菌復(fù)合群診斷。

2.2.3 MAP0862 等 Paustian 等［13］通 過(guò) 分 析MAP的基因組，鑒定了13個(gè)ORF。純化其中的5種蛋白，用其與自然感染的牛、暴露于MAP的鼠和兔的血清進(jìn)行免疫印跡分析，發(fā)現(xiàn)其中MAP0862、MAP3732c和MAP2963c幾乎可以被所有的病牛血清識(shí)別；進(jìn)一步分析MAP0862，發(fā)現(xiàn)其只與感染牛血清發(fā)生反應(yīng)，初步確定了其在診斷中的意義。Bannantine等［14］在改進(jìn)檢測(cè)羊副結(jié)核病的ELISA研究中發(fā)現(xiàn)，用重組蛋白MAP0862和MAP3786做抗原時(shí)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)較強(qiáng)，MAP0862能檢出81%的 MAP感染羊。國(guó)內(nèi)遲磊等［15］擴(kuò)增了MAP0862和MAP2154c，并進(jìn)行誘導(dǎo)融合表達(dá)，得到了76 ku的重組蛋白MAP0862/2154c，為其在診斷中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

2.2.4 MAP0865和 MAP1637c Leroy等［16］應(yīng)用生物信息學(xué)工具，從MAP的基因組中篩選出87個(gè)MAP特有的序列，通過(guò)抗原性分析選擇3個(gè)具有免疫原性的基因，應(yīng)用重組純化抗原建立的ELISA檢測(cè)方法表明，有兩個(gè)抗原特異性高于商品化的試劑盒，達(dá)到98%（后者為92%），敏感性達(dá)分別為72%和82%，前者與 MAP0865有關(guān)，被作者命名為Ag6，后者為MAP1637c。生物信息學(xué)方法的應(yīng)用為尋找侯選抗原提供了思路。

2.2.5 MAP1272c和 MAP2121c等 Li等［17］等用重組表達(dá)的MAP1272c和MAP2121c作為抗原，建立了ELISA方法，對(duì)7份陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)前者能檢出7份，后者為能檢出5份，顯示了MAP1272c在血清學(xué)診斷方面的潛在價(jià)值。Bannantine等［18］（2008年）對(duì)43個(gè) MAP重組蛋白進(jìn)行了研究，表明除 MAP3155c能與Johne＇s病牛血清發(fā)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)外，Dna K（Hsp70）、MAP2121c能被免疫的鼠和兔血清識(shí)別。

Bannantine等［19］建立了檢測(cè)血清中MAP抗體的蛋白微陣列，93個(gè)重組蛋白被點(diǎn)到硝酸纖維素上，采用健康、牛分枝桿菌感染、MAA感染牛血清鑒定這些蛋白的非特異性，結(jié)果表明與MAA感染牛血清交叉反應(yīng)更強(qiáng)；后又應(yīng)用自然或?qū)嶒?yàn)感染牛血清識(shí)別這些抗原，結(jié)果檢測(cè)到3個(gè)膜蛋白與Johne＇s牛血清發(fā)生最強(qiáng)烈的反應(yīng)，它們是侵襲蛋白、ABC肽運(yùn)輸透明質(zhì)酸酶和假定的鳥苷三磷酸蛋白。

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